海洋黄杆菌产生的新金丝菌素类抗生素BF-1抗真菌机制和作用靶标研究

金丝菌素是一类广谱抗生素，但对其作用机制和作用靶标未见报道，本项目组从海洋微生物中筛选获得的海洋黄杆菌WWP37可产生新金丝菌素类抗生素BF-1，对核盘菌等植物病原真菌有广谱抗真菌效果，其抗菌机制和其作用的靶标尚不清楚，拟通过电子显微镜观察BF-1对真菌细胞内结构的影响，同时采用生理生化方法分析BF-1作用的代谢途径，结合计算机分子模拟技术如同源模建、分子对接、分子动力学模拟等方法预测BF-1作用的靶标，采用激光共聚焦显微镜结合免疫学技术对靶标进行精确定位，运用免疫印迹技术和蛋白组学技术如双向电泳和质谱技术对靶标进行分离﹑鉴定和序列分析，并与计算机分子模拟结果进行比较，获得新金丝菌素类抗生素BF-1对植物病原菌作用靶标，从而揭示其作用机制，为改造和重新生物合理设计新一代高效低毒金丝菌素类抗生素和建立针对病原真菌靶标先导化合物高通量筛选打下理论基础。

植物病害一直是世界农业发展的主要危害之一，每年因植物病害而引起的农业损失非常严重。当前，在化学农药滥用、耐药性严重的情况下，寻找新型的无公害、易降解的生物农药，符合可持续发展农业的需求。研究者们希望从海洋微生物中开发出可抗植物病原菌的生物活性物质，用以减少或者替代化学农药的使用。.本研究初期对象为一株命名为WWP37的黄杆菌产生的金丝菌素BF-1的作用机理，其对核盘菌具有显著抑菌效果，对其作用机制进行了初步研究，由于发酵产物活性物质量极少，且难以分离纯化，皆不能获得足够的进行进一步机理研究的量。为此对该课题研究内容进行调整。以一株对水稻黄单胞菌具有显著抑菌效果的海洋枝芽胞杆菌A493作为研究对象，研究其产生的新的氨基糖苷类活性物质Z11进行了抗菌机制研究。.活性物质理化性质研究表明，Z11可以耐受100 ℃的高温，在pH 4-10和紫外照射环境中活性稳定，可以通过3 kDa的超滤管，并且对蛋白酶不敏感，只能溶解于水和甲醇。酸沉淀和硫酸铵沉淀实验结果排除了活性物质是脂肽类物质的可能性，研究显示该活性物质是极性较强的水溶性活性小分子化合物。对A493产活性物质发酵条件进行优化，使其单位体积发酵液抑菌效果提高18%。活性物质相对效价测定的实验表明，A493发酵无菌上清液对水稻黄单胞菌的抑菌效果相当于15.6 µg/ml的标准链霉素。对水稻白叶枯病害的生防实验表明，经过A493无菌上清液处理，水稻生长20天后对水稻白叶枯病害防治效果达到了66.7%，且对水稻的正常生长也无不良影响。.Z11的分离纯化采取正相硅胶粗分，反相硅胶细分并结合具有极性分配和分子筛作用的Sephadex LH-20凝胶柱层析纯化，纯化后的样品经过质谱和紫外全波段扫描发现活性物质Z11有末端吸收现象，通过Doskochilova系统方法判断为一种新型的氨基糖苷类抗生素。 .活性物质Z11抑制黄单胞菌的浓度范围和抗菌作用机理研究发现A493抑制黄单胞菌的浓度范围在14-56 μg•mL_1。机理研究显示活性物质不改变病菌细胞膜通透性，但能影响黄单胞菌蛋白质的合成和细胞壁的合成关键酶N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶（GlmU）的活性，GlmU酶蛋白可能为潜在靶标。