油瓶霉属真菌Coniochaeta cephalothecoide抗真菌活性物质的发现与作用机制研究

The research and development of antifungal drugs is seriously lagging behind the increasing morbidity and mortality of fungal infection and drug resistance in clinics. Thus, it is imperative to find out more efficient and security antifungal drugs. In the process of long-term evolution and adaptation, fungi living in the extreme environments have developed a unique secondary metabolic network that can product secondary metabolites with delicate structure, potent biological activity, and unique mechanism of action, and from which some very important medicines have been discovered. Through screening of the culture extract from 300 strains of fungi isolated from Tibetan plateau for the antifungal activity in vitro, the ethyl acetate extract of Coniochaeta cephalothecoides. was shown to display significant antifungal activity against Candida albicans and Aspergillus fumigatus. Preliminary investigation on the action mechanism indicated that the bioactive components produced by this fungus inhibited the biosynthesis of chitin in the cell wall and thus interrupted the polar growth of mycelia. In this project, the antifungal bioactive compounds will be isolated and identified by application of chromatographic and spectroscopic techniques; the bioactivity and action mechanism for new compounds are evaluated on the basis of in vivo animal model and molecular biology analysis.

目前临床可用的抗真菌药物种类非常有限,且耐药现象日趋严重,亟待开发新型、高效、安全的抗真菌药物。特殊生境真菌在长期进化中形成了独特的次级代谢网络，能够产生结构复杂新颖、生物活性显著、作用机制独特的次级代谢产物，是创新药物发现的新资源。通过对300株青藏高原特境真菌发酵产物的体外抗真菌活性筛选，发现一株墨脱县来源油瓶霉属真菌发酵物对白色念珠菌和烟曲霉显示显著的抑制活性。初步机制分析表明活性物质通过抑制真菌细胞壁几丁质合成干扰真菌极性生长发挥抗菌作用。本项目以该株真菌为研究对象，应用各种色谱、波谱方法分离鉴定活性化合物；利用体内外模型进行活性筛选和活性验证；探究活性化合物的抗真菌作用机制。通过本研究可以为研发高效低毒的抗真菌药物提供先导化合物，为研究病原真菌生物学提供小分子探针。

本项目首次对西藏墨脱来源油瓶霉属真菌Coniochaeta cephalothecoide抗真菌活性物质（L821）进行深入的化学研究。综合运用多种现代色谱学分离手段对其进行活性指导下的追踪分离，利用化学和现代光谱学方法鉴定了分离得到的24个单体化合物的结构，包括19个新结构的化合物。化合物1-4和7均为一对外消旋混合物，通过手性拆分，得到5对对映异构体。化合物1a/1b和2a/2b通过单晶衍射和计算ECD的方法确定了其绝对构型，而化合物3a/3b、4a/4b和7a/7b主要是采用计算ECD的方法确定了其绝对构型。单体化合物的活性评价结果显示，化合物11对病原真菌白色念珠球菌和烟曲霉具有较好的抑制作用，MIC分别是3.13和1.56 μM，深入研究发现该化合物是一种新的几丁质抑制剂。化合物5对金黄色葡萄球菌和MRSA均具有较好的抗菌活性，MIC均为0.97 μM。研究结果初步阐明了这该菌的抗真菌活性物质基础及其作用机制，为其进一步开发新的抗真菌药物提供了坚实的理论依据和实验基础。.此外，为了进一步寻找抗真菌活性物质，项目还进行了广泛的抗真菌活性菌株的筛选，从人皮肤和小鼠肠道中分离得到30余株真菌，由于其特殊的生长环境，其中有两株对烟曲霉和新生隐球菌生长均具有较好的抑制活性，高效液相色谱和薄层色谱分析显示活性菌株的粗提物中含有丰富的次级代谢产物，紫外光谱分析表明其主要代谢产物在220-400 nm范围有特征的紫外吸收，说明这两株共生真菌可能会产生结构类型丰富的抗真菌活性物质。随着深入研究，有望发现更多新颖的抗真菌活性物质。