中药配合肺腺癌放疗S100A9、亲环素A表达变化及RNAi抑制其表达对放射敏感性的影响

我们既往用比较蛋白组学已得出中药复方的放射增敏靶点为S100A9和亲环素A，但这只是初步的定性研究、而不是定量的研究。为具体中药复方放射增敏靶点和这些靶点与放射敏感性的关系，本课题拟从两方面深入研究：第一方面用Northern-blot、Western-blot技术，对比中药加放射组、单纯放射组的S100A9、亲环素A变化，从基因、蛋白角度量化这2个靶点的表达情况，之后具体中药对肺腺癌放射增敏的靶点；第二方面用RNAi技术剔除肺腺癌细胞的S100A9、亲环素A，再用Northern-blot、western-blot、流式细胞仪等方法，观察剔除这些基因的肿瘤在放疗后基因、蛋白、细胞、组织等各个层面的放射生物学变化，了解靶点基因缺失与放射敏感性的关系，此为肺腺癌放射敏感性预测因子的确定及为放射增敏基因药物与动物研发具有极为重要意义。

目的：确定S100A9、亲环素A在扶正增效方对肺癌放射增敏中作用。用RNAi技术验证放射增敏相关靶点S100A9、CyPA。.方法：建立裸鼠人肺癌移植瘤模型，当瘤积1cm3时，一次给予相关组瘤体10Gy照射。观察抑瘤率；Western blot检测S100A9、CyPA 蛋白表达；RT-PCR检测其 mRNA表达；.　　慢病毒介导目的基因S100A9、CyPA敲降。干扰后体外实验分为空白组、阴性对照(PBS)组、RNAi S100A9组、RNAiCyPA组，照射后集落形成实验计算克隆生成率、存活分数，利用单击多靶模型评价辐射增敏比，流式细胞仪测细胞周期；体内试验建立裸鼠人肺癌移植瘤模型分为未放射空白组、放射空白组、未放射阴性对照组、放射阴性对照组、S100A9未放射组、S100A9放射组、环素A未放射组、亲环素A放射组，当瘤积1cm3时，一次给予相关放射组瘤体10Gy照射。.结果：与其它组相比，中药加放射组抑瘤率显著增高。Western blot结果：放射后24h，S100A9、CyPA蛋白表达，中药+放射组表达相对各组均有显著性差异（P<0.05）。RT-PCR结果：放射后12h、24h，中药+放射组表达相对各组均有显著性差异（P<0.05）。.　　RNAi（S100A9、CyPA）后体外实验：利用单击多靶模型得出降低了肿瘤细胞SF2Gy值、D0值、Dq值，增加了辐射效应，增强射线对肿瘤细胞的杀伤作用。流式细胞仪检测发现，未照射时，G2/M期细胞，S100A9组与CyPA组相对空白组显著增加；2Gy照射后，S100A9和CyPA组相对空白组和对照组，G0/G1期细胞明显减少（P<0.05），G2/M期细胞显著增多（P<0.05），CyPA组S期细胞显著降低（P<0.05）。体内试验：S100A9放射组与CyPA放射组对比单纯放射组抑瘤率显著提高。放射24h后S100A9放射组与CyPA放射组的S100A9、CyPA的mRNA、蛋白表达显著降低；细胞凋亡明显增多。.结论：扶正增效方通过下调S100A9和CyPA表达而放射增敏。用慢病毒介导基因敲降技术验证了S100A9和CyPA是肺癌放射增敏靶点。