整合神经元单细胞形态和转录组信息的细胞分型新方法

Neuronal cell typing is a fundamental question in current brain science. The traditional way to classify neurons is according to single dimensional information such as neuron morphology and electrophysiological characteristics, which has great limitations. Recently, single cell transcriptome technology combined with electrophysiological technology can obtain two- dimensional information and classify neurons more accurately. However, single cell transcriptome information is difficult to integrate single cell morphology for cell typing, because there are mRNA breakage, loss and degradation after obtaining single cell morphology from the same sample. In order to overcome the difficulties and to develop a new method for cell typing by integrating neuronal single cell morphology and single-cell transcriptome, we change our ideas. Take V1 SST neurons as an example, the morphological information and transcriptomic information are not integrated directly in the same mouse brain but in two mouse brains (same age and same strain, littermate mice are better) respectively. The indirect integration of the two dimensional information is mediated by in situ hybridization. Using this method, the cell typing of SST neurons in mouse V1 will be conducted to reveal the morphological rules and differences within these different types. This method is expected to provide important support for the survey of neuron cell types, the study on the projections and function of a specific type of neurons, and even the study on the relationship between neuron morphological projection and gene expression.

神经元细胞分型是当前脑科学研究的基础问题。传统方法根据神经元形态、电生理特性等单一维度信息分类，具有较大局限性。新近的单细胞转录组技术结合电生理技术获取双维信息，能够更精确地分类研究神经元。然而单细胞转录组信息却很难整合单细胞形态用于细胞分型，因为同一样本获取单细胞形态后，存在mRNA断裂、流失和降解。为克服这一难点并建立整合神经元单细胞形态和单细胞转录组双维信息的细胞分型新方法，本研究转换思路，以小鼠V1脑区SST神经元为例，不在同一只鼠脑上直接整合形态和转录组信息，而是在两只鼠脑上（相同年龄同品系小鼠，同窝小鼠更好）分别获取转录组信息和形态信息，通过原位杂交介导来实现双维信息的间接整合。利用这一方法，研究小鼠V1脑区SST神经元的细胞分型，揭示不同分型的投射规律与差异。本方法有望为神经元细胞类型普查，特定类型神经元的投射与功能研究，乃至神经元形态投射与基因表达的关系研究，提供重要支撑。

针对哺乳动物全脑上整合神经元单细胞形态与单细胞转录组信息缺少有效方法的问题，本项目利用腺相关病毒标记活体小鼠SST神经元，灌流后首先固定住mRNA并进行快速的光片断层成像，然后选择性收集脑片，以相同年龄同品系小鼠或同窝小鼠单细胞转录组确定的能够代表神经元转录组细胞类型的标签基因为靶标，在脑片上进行原位杂交，之后将原位杂交信息配准到单个神经元在全脑的三维形态数据中，从而在小鼠全脑上建立整合神经元形态和单细胞转录组信息的方法，为更加准确研究哺乳动物大脑神经元细胞类型、全面认识神经元功能奠定方法基础。项目主要研究内容包括：.1）发现配体依赖的绿色荧光蛋白UnaG在哺乳动物小鼠活体内标记大脑神经元时，不需要额外添加外源配体胆红素，体内存在的胆红素就足以激发出UnaG的强荧光，从而使小分子蛋白UnaG能够作为AAV载体的报告分子，标记出神经元的单细胞形态，标记效果和EGFP相当。相比EGFP，UnaG更优势的地方不仅是分子量更小，荧光亮度更高，而且还表现在pH耐受性更强，在SeeDB水性透明试剂的处理中具有更高的荧光保持率。.2） 采用AAV稀疏标记SST-Cre小鼠大脑V1脑区SST神经元，灌流获取鼠脑后先固定住mRNA以尽可能减少流失和降解，之后通过快速的软包埋和光片断层成像获取神经元单细胞形态信息，然后选择性收集成像之后的脑片进行标签基因的表达分析。小鼠V1 脑区SST神经元包含至少6种转录组细胞类型，能够代表各自细胞类型的标签基因分别有Th、Tacstd2、Myh8、Cbln4、Cdk6、Chodl。本研究获取了这些标签基因的表达信息，实现了鼠脑神经元单细胞转录组信息和单细胞形态信息的间接整合。