基于茋类成分和Akt/GSK-3β/β-catenin通路研究白及诱导肺癌细胞自噬的物质基础及作用机制

Lung cancer is one of the malignant tumors with the highest morbidity and mortality. The tubers of Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., “a good pulmonary medicine” in traditional Chinese medicine (TCM), are a drug of the first choice for lung diseases in the clinic of TCM. Thus, the applicant explored the effect on lung cancer cells of B. striata. The experiments not only found that the EtOAc extract could induce autophagy in A549 cells, but also revealed that stilbenoids were the main components in the active fraction. Then, further studies were performed to explore the molecular mechanism. As a result, the active fraction inhibited phosphorylation of AKT and GSK3β, and the nuclear translocation of β-catenin. Based on the above experiment foundation and literature analysis, this project proposes a hypothesis that stilbenoids of B. striata may induce A549 cells autophagy by regulating expression of autophagy activating factors through Akt/GSK-3β/β-catenin signaling pathway, and Beclin 1 may be the key factor. Thus, this project intends to perform further researches. By using chromatographic and spectroscopic techniques, stilbenoids will be isolated quickly from the active fraction of B. striata, and the main constitutes in the active fraction will be illuminated. Subsequently, this project will assay their cytotoxic activity and induction effect of autophagy in A549 cells by high content imaging system. Then, molecular biological techniques will be used to study the effects of active stilbenoids on key proteins and genes of Akt/GSK-3β/β-catenin signaling pathway and the downstream autophagy activating factors. In addition, shRNA silencing will be constructed to investigate whether Beclin 1 is the key autophagy activating factor. Through the above study, this project is expected to illuminate the material basis and molecular mechanism for inducing autophagy in lung cancer cells of B. striata, which can provide evidences for the clinical application in anti-human cancer of B. striata.

肺癌是常见恶性肿瘤之一，发病率和死亡率居癌症首位。白及作为肺科良药，为中医治疗肺部疾病的首选药物。因此，申请人前期探索了白及对肺癌细胞的作用，不仅发现乙酸乙酯部位可诱导A549细胞自噬，而且明确了活性成分群为茋类，进一步试验发现Akt和GSK-3β磷酸化被抑制，β-catenin入核减少。基于以上基础及文献分析，本项目提出：白及茋类可能通过Akt/GSK-3β/β-catenin通路调控下游自噬启动因子发挥作用，且Beclin 1可能为关键因子。因此，拟开展深入研究：应用色谱和波谱技术获得茋类成分，阐明活性成分群的组成；应用高内涵成像系统检测茋类成分诱导A549细胞自噬的作用；应用分子生物学技术研究活性成分对该通路及下游自噬启动因子蛋白和基因表达的影响，并采用基因沉默技术验证Beclin 1是否为关键因子。通过上述研究，以期阐明白及诱导肺癌细胞自噬的物质基础和机制，为其抗肺癌应用提供依据。

肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率居癌症首位。针对肺癌生存率低且现代手术、化疗和放疗等传统治疗方案效果不理想的现象，本项目基于中医药理论指导，选择中医治疗肺部疾病的首选药物——“肺科良药”白及作为研究对象。现代研究虽然有白及抗肺癌的报道，但具体的药效物质和作用机制有待进一步阐明。本项目基于前期对白及诱导肺癌A549细胞自噬的活性研究及作用机制初探，提出“白及茋类可能通过Akt/GSK-3β/β-catenin通路调控下游自噬启动因子发挥作用，且Beclin 1可能为关键因子”的科学假说。项目开展以来，以白及诱导A549细胞自噬的乙酸乙酯提取部位为基础，采用UPLC-Tof-HRMS联用技术，快速且高效地追踪了活性成分群；应用现代色谱和波谱技术分析分离目标成分茋类化合物，阐明了活性成分群的主要组成；筛选了白及茋类成分对A549细胞的细胞毒作用，并探讨了构效关系；应用Annexin V/PI染色法明确了白及茋类成分诱导A549细胞自噬的作用；应用分子生物学技术研究了活性成分对Akt/GSK-3β/β-catenin通路及下游自噬启动因子蛋白和基因表达的影响，并采用基因沉默技术验证了Beclin 1是否为诱导自噬的关键因子。通过本项目的研究，明确了茋类成分（联苄类和菲类）是白及诱导A549细胞自噬的活性成分群，共获得联苄类和菲类化合物共51个，包括23个新化合物，包括多对新颖的对映异构体，并获得了一定的构效关系，有利于白及抗非小细胞肺癌活性成分的寻找；证实了项目申请时提出的假说，白及茋类可通过Akt/GSK-3β/β-catenin通路调控下游的自噬启动因子Beclin 1、LC3和p62，其中Beclin 1是关键自噬因子。此外，本项目还发现白及茋类化合物除了调控Akt/GSK-3β/β-catenin通路以外，还可抑制A549细胞增殖和诱导A549细胞凋亡，其作用机制与抑制Akt/MEK/ERK信号通路和影响Bcl-2与Bax有关。本项目的研究结果具有较好的创新性，发现了一系列白及诱导A549细胞自噬的新颖活性成分，不仅在一定程度上阐明了白及抗肺癌的物质基础和作用机制，而且有利于抗肺癌创新药物成分的探索和研究。本项目也很好地完善了对“肺科良药”白及传统功效的现代认识，为白及抗肺癌应用提供了更多现代依据。