拟南芥一氧化氮合酶(NOS)解析及NO信号途径对(水分)胁迫的应答

Nitric oxide (NO) is involved in various aspects of important physiological and pathological processes in animals and plants. It has been shown that NO could be produced through the nitric oxide synthase (NOS) pathyway in mammalian cells. The discovery of NOS has greatly promoted the reseaches on NO function in animal. However, the exitence of NOS have not been confirmed in higher plants, which is a great obstacle to the intensive studiy of NO functions in plants. The applicant’s researching group has screened for Arabidopsis mutants hypersensitive to NO with forward genetic approaches. After 10 years of investigation, we have obtained and analyzed a series of NO signaling related mutants . Functional analysis of mutant hw6 indicated that the HW6 protein exhibited NOS activity both in vitro and in vivo. In this project, we will further confirm the NOS activity of HW6 from different aspects, purify high quality of HW6 protein for protein crystal structure analysis to interpret the structural basis of its function and determine the binding sites of NOS cofactors, screen for interaction proteins of HW6 to reconstruct the NO signaling pathway and identify transcription regulating factors of HW6 gene to investigate the role of NO signaling related to stress (especially dehydration stress)responses.

一氧化氮（NO）参与生物体内许多极为重要的生理和病理过程。研究表明哺乳动物（包括人）细胞存在一氧化氮合酶（NOS），催化NO的产生，而NOS的发现对NO信号途经的功能解析起到了关键作用。迄今仍未找到植物的NOS，这也阻碍了深入研究NO在植物体中的功能。申请者通过建立的遗传学方法获得了多个与NO信号途经相关的拟南芥突变体，经过10余年研究，克隆到一批与NO相关的基因并对其生物学功能进行深入分析；对候选基因HW6的功能分析结果显示，在in vitro和in vivo条件下HW6具有NOS活性。该申请项目将继续完善遗传材料、从多层面确定HW6的NOS属性；获得HW6的高质量纯化蛋白质，解析其晶体结构，确定其结合关键辅酶的特异位点；分离HW6的互作蛋白; 寻找HW6基因的“转录调控因子”，解析NO信号途经在（水分）胁迫应答中的调控特征。

哺乳动物中（包括人）一氧化氮合酶（NOS）以L-精氨酸为底物，经过氧化还原反应产生NO和瓜氨酸；NO作为信号分子的系列研究成果1998年获诺贝尔奖。..生理生化数据显示，植物存在以L-精氨酸为底物产生NO途径，但迄今未发现其NOS（Cell 2003, Science 2003论文公布的具有NOS功能蛋白，均未被学术界认可），这严重阻碍了深入研究NO在植物体中的生物学功能。..申请者自2002年聚焦于植物NO信号与环境应答研究，通过正向遗传学方法，克隆多个与NO信号途径相关基因并对其生物学功能进行了深入分析。该项目对NOS候选者HW6的生物学功能进行了深入分析，获得以下主要结果。..1. 遗传与药理学技术分析等结果显示，HW6基因表达与植物细胞的NO水平密切相关，四氢蝶呤（H4B）和四氢叶酸（H4F）均可影响植株的“NOS活性”。但是，人和哺乳动物NOS可用四氢蝶呤（H4B）而不能以四氢叶酸（H4F）作为辅基；..2. 生化生理实验结果显示，in vivo条件下HW6具有NOS活性。在人、昆虫、酵母、大肠杆菌等多种培养细胞中表达纯化HW6蛋白质，采用L-精氨酸同位素标记、Griess法、PHLC和Ni原子纳米电极等方法技术，均检测到HW6蛋白质具有NOS活性；..3. 纯化HW6蛋白质，迄今未能长出理想晶体（只获得针状晶体，不能用X-衍射技术解析其晶体结构）。但是，我们解析了与HW6具有互作可能是其“NOS功能复合体”成员的Art2和P450蛋白质的晶体结构；..4. 鉴定出HW6基因的转录调控因子，建立了：逆境-ABA-转录调控因子-HW6-NO的信号通路，首次揭示出ABA与NO信号在逆境应答中的分子作用机制。