基于造血微环境及骨髓超微结构的针灸改善CTX化疗小鼠骨髓抑制的机制研究

The hematopoietic microenvironment in the bone marrow is the "soil" of the hematopoietic stem cell proliferation, differentiation and mature, playing an important role to support and regulation of the hematopoietic cells. The project on the basis of the previous research, surrounding the hematopoietic microenvironment in the bone marrow, from bone marrow hematopoietic stem cell homing, proliferation and differentiation, and migration of hematopoietic cytokines, adhesion molecules and microvascular damage of endothelial cell growth factor, etc. Application of the flow cytometry instrument, ELISA, fluorescent double labeling, RT-qPCR, Western-blot, and other methods to explore the role of the molecular mechanisms; And through the transmission electron microscopy,the 2d and 3d morphology measurement technology, observe the ultrastructural morphology changes of the bone marrow, From the Angle of molecular biology and morphometric study and discussion on acupuncture and moxibustion on CTX chemotherapy repair and protection of the mechanism of action of bone marrow hematopoietic microenvironment, To reveal the mechanism of acupuncture and moxibustion resistance to radiation and chemotherapy side effects to provide new experimental basis.

骨髓造血微环境是造血干细胞赖以增殖、分化和成熟的“土壤”，对造血细胞起着重要的支持和调节作用。本项目在前期研究的基础上，围绕骨髓造血微环境，应用流式细胞术、ELISA、荧光双标、RT-qPCR、Western-blot等多种方法检测与骨髓造血干细胞的归巢、增殖、分化、迁移等密切相关的造血细胞因子、黏附分子和微血管损伤修复的内皮细胞生长因子等指标；通过透射电镜、二维和三维形态学测量技术，观察骨髓超微结构的形态变化，从微观分子生物学和形态测量学的角度探讨针灸对环磷酰胺（CTX）化疗小鼠骨髓造血微环境修复和保护的作用机制，为揭示针灸抗放化疗毒副作用的机理提供新的实验依据。

本研究以环磷酰胺（CTX）诱导骨髓抑制模型小鼠，通过动态观察其骨髓造血微环境（HM）功能和形态结构的损伤程度，明确针刺、艾灸干预拮抗化疗所致HM损伤所起到的保护与修复作用。从HM中筛选出与造血干/祖细胞（HSPCs）的静息态活化、粘附、定位、归巢、聚集体增殖与分化、迁移、存活、中性粒细胞释放等功能密切相关的靶向指标，运用流式细胞术、光镜（姬姆萨染色）、免疫组织化学法、高通量转录组测序技术（RNA-Seq）、ELISA、RT-PCR、Western-blot法等检测手段，对干细胞因子（SCF）、转化生长因子β1（TGF-β1）、骨髓基质细胞衍生因子（SDF-1α，即CXCL12）、CXC族趋化因子受体4（CXCR4）、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、血管内皮粘附分子l（VCAM-1）、血管内皮生长因子（VEGF）及其受体-2（VEGFR-2）、骨髓基质细胞亚群多能性相关因子Sox-2、cMyc、hTert、分泌明胶酶A（MMP-2）、分泌明胶酶B（MMP-9）等指标进行数据化的动态观察与分析，得出以下结论：.（1）针灸可拮抗CTX化疗所致骨髓抑制，快速提升外周血白细胞（WBC）。.（2）针灸可良性调节HM中骨髓基质（BMSCs）细胞周期，拮抗化疗药物对骨髓HSCs的损伤，提高对造血干细胞（HSCs）的支持能力，使其增殖恢复正常并促进其向中性粒细胞分化，提升成熟骨髓源中性粒细胞（CD11b+Gr-1+细胞）的细胞水平。.（3）针灸可保护CTX模型小鼠HM的核心基础，即BMSCs细胞群、微循环（微血管和血窦）系统和小鼠微神经（NeuN+细胞）结构，并促进其结构修复。.（4）针灸可通过调节CXCL12/CXCR4生物轴以及VEGF/VEGFR-2生物轴相关基质细胞增殖的正向调节、细胞成熟、调节造血祖细胞分化、血管生成等途径，实现对CTX模型小鼠骨髓HM的修复。.（5）针灸可①“良性上调”骨髓造血微环境（HM）中CXCL12（即SDF-1α）、MMP2、MMP9、c-Myc、VCAM-1、SCF、ICAM-1；②“良性下调”CXCR4、VEGF、VEGFR-2、SOX2、TERT、TGF-β1等靶向指标的蛋白含量、mRNA表达水平与蛋白表达水平。