雌激素介导NLRP3炎性体抑制肝细胞肝癌发生的分子机制

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumors and the third leading cause of cancer-related death worldwide. Although estrogen has been reported as a protective factor in HCC occurrence, whether and how it prevents and attenuates HCC remains to be elucidated. NLRP3 inflammasome is a multi-protein complex in cytoplasm, whose activation could initiate inflammation. Our previous study showed that NLRP3 inflammasome de-regulation was correlated with pathological grade and TNM stage of HCC. Further study proved NLRP3 inflammasome could be up-regulated by E2 and ERβ. It suggests that E2 exerts anti-tumor effect by regulating NLRP3 inflammasome, but the molecular mechanism remains unknown. To clarify the major pattern and mechanism by which NLRP3 inflammasome activation induced death of HCC cells, we intend to investigate effect of its activation on pyroptosis and autophagy in E2-stimulated HCC cells, and to determine their regulation to survival and death of HCC cells in detail. Our study will provide scientific basis for protective role of E2-induced NLRP3 inflammasome activation in HCC development.

肝细胞肝癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一, 死亡率居恶性肿瘤第三位。研究表明雌激素对肝细胞肝癌发生具有抑制作用，但其下游特异性靶分子和具体调控机制不明。NLRP3炎性体是哺乳动物细胞胞浆中一类多分子复合物，其活化可促进炎症反应。课题组前期发现，NLRP3炎性体表达失调与肝癌病理进程密切相关；雌激素及其受体ERβ对NLRP3炎性体有明显的正调控作用，提示雌激素极有可能通过靶向NLRP3炎性体发挥抑制肝癌发生的效应，然而具体的调控机制仍有待进一步明确。为了详尽阐明NLRP3炎性体在雌激素抑制肝癌发生中发挥的作用及可能机制，本课题拟通过体外实验和肝癌荷瘤裸鼠模型明确雌激素诱导的NLRP3炎性体活化对细胞炎症性死亡（pyroptosis）和自噬作用的影响，并在基因和蛋白水平详尽分析二者对肝癌细胞生存和死亡的重要调控作用，为揭示雌激素抑制肝癌发生的作用机制和锚定雌激素通路下游特异性靶标提供理论依据。

目的：课题组前期研究发现，E2通过靶向激活NLRP3炎性体来抑制HCC发生和进展，然而具体的调控机制仍有待进一步明确。本研究旨在探讨NLRP3炎性体活化对肝癌细胞死亡途径和自噬作用的影响。.内容：以E2刺激HepG2肝癌细胞系，分析细胞死亡率的变化，通过检测细胞凋亡和焦亡水平，明确NLRP3炎性体活化后肝癌细胞的死亡途径。利用RT-PCR法，real-time PCR法和western blot法检测不同剂量E2刺激肝癌细胞时自噬相关基因和蛋白的表达变化以及自噬小体形成量的变化，并利用western blot法检测自噬相关信号通路的磷酸化水平，从而研究NLRP3炎性体活化对肝癌细胞自噬作用的影响。应用3-MA抑制细胞自噬作用，Yvadcmk抑制caspase1活化，观察自噬作用和细胞焦亡的相互作用关系。.结果：台盼蓝实验和LDH释放实验表明，E2刺激肝癌细胞后细胞死亡率显著升高，western blot和ELISA实验显示，E2处理肝癌细胞前后，细胞凋亡相关蛋白的表达并无明显差异，而E2刺激肝癌细胞后IL-1β浓度明显升高，ERβ受体被封闭后IL-1β浓度继而下降，表明E2及ERβ受体激活NLRP3炎性体可介导IL-1β产生和分泌，发生细胞焦亡。E2处理肝癌细胞后，LC3b和BECLIN-1基因和蛋白表达呈E2剂量依赖性降低，细胞死亡率则逐渐升高，该结果表明，E2刺激肝癌细胞，通过ERβ受体激活NLRP3炎性体，继而可抑制细胞自噬作用。Western blot结果表明，m-TOR/AMPK通路可能参与介导自噬作用。在细胞自噬与焦亡的相互关系研究中，自噬作用被抑制再由E2刺激肝癌细胞，细胞死亡率升高，细胞焦亡被抑制再由E2刺激肝癌细胞，细胞死亡率显著降低。.结论与研究意义：本研究表明，E2刺激肝癌细胞介导NLRP3炎性体活化，通过细胞焦亡引发肝癌细胞死亡，自噬对细胞存活起到保护性作用，E2刺激细胞可抑制自噬，促进细胞死亡。本研究将有助于阐明NLRP3炎性体在雌激素抑制HCC发生的作用及可能机制，NLRP3炎性体为有效逆转和抑制HCC发生提供潜在的治疗靶标。