利用体外胚胎干细胞神经分化模型对多溴联苯醚神经发育毒性作用机制的研究

多溴联苯醚(PBDEs)的神经发育毒性作用机制目前尚无明确结论。本研究拟采用小鼠胚胎干细胞体外胰岛素-转铁蛋白-硒-纤维连接蛋白（ITSFn）神经分化培养模型，通过观察三种PBDEs对体外神经分化胚胎干细胞的生长、增殖和相关分化控制关键基因表达的影响，对神经分化胚胎干细胞的氧化应激及凋亡诱导作用及其机制，对胚胎干细胞神经分化获得的多巴胺能神经元突出生长、突触联系建立和释放多巴胺神经递质能力的影响，以及甲状腺激素对PBDEs干扰胚胎干细胞神经分化过程的影响等方面，研究PBDEs神经发育毒性的作用机制，确定作用的关键环节，为进一步深入研究PBDEs的神经发育毒性作用特点探索新的思路和研究手段。

本课题采用小鼠胚胎干细胞体外胰岛素-转铁蛋白-硒-纤维连接蛋白（ITSFn）神经分化培养模型，研究多溴联苯醚（PBDEs）的神经发育毒性机制及其作用的关键环节。.研究方法.1.以ITSFn法为基础建立多巴胺能神经元神经分化模型。2.利用RealTime-PCR、免疫组织化学方法以及MPTP检测多巴胺能神经元的存在。3.采用Real Time-PCR检测相关分化基因的表达；利用ELISA及比色法检测细胞毒性、氧化应激的变化；通过流式细胞仪检测凋亡状况；利用免疫荧光法及Image Pro Plus 6.0分析突触延伸和突触联系的变化。.结果.1.PBDEs对神经分化起始的Sox2、Oct4以及对神经分化过程中的protein kinase C-α等有抑制；甲状腺素对于PBDEs的干扰效应有抑制作用。.2.PBDEs显著增加氧化负荷如GSH，SH集中影响于神经分化后期；甲状腺素对于PBDEs的增加氧化负荷效应有抑制作用。.3.PBDEs显著降低抗氧化能力如过氧化氢酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）、过氧化氢酶（CAT），影响神经分化的胚胎期、神经前体细胞及成熟神经元分化增殖期；甲状腺素对于PBDEs氧化损伤有抑制作用。.4.PBDEs显著增高细胞初期凋亡率，集中影响神经发育胚胎期nestin+细胞筛选阶段，神经前体细胞及成熟神经元形成期；甲状腺素对于凋亡诱导有抑制作用。.5.PBDEs显著降低细胞膜的唾液酸活力，钠钾ATP酶活力，钙镁ATP酶活力，影响集中于nestin+细胞形成期，神经前体细胞及成熟神经元形成期；甲状腺素对此具有抑制作用。.6.PBDEs会抑制树突、轴突的延生，影响集中于神经前体细胞及成熟神经元形成阶段；甲状腺素对此有抑制作用。.7.PBDEs、甲状腺素对突触前后蛋白的形成无影响。.结论.1.分化模型在基因表达、蛋白、功能方面有效重现了神经发育过程，可以用于神经发育毒性研究。.2.三种PBDEs具有神经发育毒性，且机制为影响分化基因表达，增加氧化负荷，降低抗氧化能力，影响细胞膜唾液酸、ATP酶活力，诱发早期凋亡，影响发育中神经突触的延伸。.3.PBDEs的神经发育毒性作用集中于胚胎发育、神经前体细胞形成和多巴胺能神经元分化阶段。.4.甲状腺素对于PBDEs的神经发育毒性在作用途径间，都具有抑制作用。