利用RNA干涉标签技术鉴定丹参酮生物合成相关新基因

最近，丹参的基因组框架图已完成，丹参的功能基因研究进入新阶段。丹参酮是丹参主要药用活性成分，但其生物合成下游途径及调控机制还很不清楚。RNA干涉标签技术是近年来应用于模式植物的一种新的基因鉴定技术，与其它基因标签技术或同源基因克隆技术方法相比，具有很多优势。本项目拟以丹参品种"99-3"为材料，利用RNA干涉标签技术鉴定丹参酮生物合成途径相关新基因。主要步骤包括制备丹参根部均一化cDNA、通过滚环复制介导的方法制备丹参的RNA干涉标签文库，通过农杆菌介导的方法制备丹参的RNA干涉标签突变体库，突变体库筛选及鉴定相关基因等。本项目拟在三年内筛选出100个左右与丹参酮合成相关的突变体，获得10到15个丹参酮合成相关新基因，并初步鉴定2到3个新基因的功能。本研究能解决丹参功能基因研究中的一些难题，能为药用植物功能基因研究提供新方法，并能为丹参的分子育种及利用生物技术生产丹参酮提供研究基础。

突变体鉴定和分析是一种研究基因功能的重要手段。近年来，药用植物丹参的基因组已经得到了初步解析，遗传转化系统也已经建立。本项目以丹参作为材料，通过构建RNA干涉标签突变体的方法，来鉴定与丹参酮生物合成相关基因。本项目通过分子遗传学方法和生物信息学方法，利用已获得的丹参基因组高通量测序数据，鉴定了丹参酮生物合成相关的一些重要基因。所获得的重要结果包括：1）应用丹参根部RNA，制备了丹参根部全长均一化cDNA，并构建了RNA干涉标签载体，丹参的遗传转化也已取得了重要成果。研究结果表明，利用RNA干涉标签技术鉴定丹参酮生物合成相关基因的思路具有创新性和可行性，但是RNA干涉标签载体的构建过程较为复杂，丹参的遗传转化效率与预期有一定差距，需要对RNA干涉标签技术和丹参的遗传转化技术进一步改进，并做出长期规划。与此工作相关文章发表于《中药材》。2）利用丹参基因组高通量测序数据，对与丹参酮生物合成相关的基因家族与新基因进行了分析，鉴定了40个丹参基因组中与萜类生物合成相关的基因，其中有27个是新基因。这些基因属于19个基因家族，编码丹参萜类化合物生物合成早期阶段所有的酶。这些基因具有不同的结构，编码蛋白具有不同的保守结构域。通过组织特异性表达和茉莉酸甲酯诱导表达分析，这些基因具有不同的组织表达特征和诱导表达模式。通过系统进化分析，这些基因及其所编码的酶具有不同的进化特征。通过对所有数据的分析，所分析的40个基因中，有20个是与丹参酮的生物合成相关的。相关文章以第一作者发表于国际刊物《Journal of Experimental Botany》，该刊物当年SCI影响因子为5.242。3）对丹参基因组中的一些其它重要功能基因也进行了分析，如与丹参鲨烯生物合成相关的基因SmSQS1与SmSQS2，相关实验结果发表于中药学领域核心期刊《中草药》。除此以外，本项目还在国际期刊《Single-Cell Biology》上发表一篇有关突变体研究在药用植物中的应用的评论文章。总的说来，本项目在丹参功能基因研究领域取得了一些有价值的成果。