基于功能DNA纳米技术的LSAW生物传感器技术的建立及在地中海贫血基因检测中的应用研究

Single nucleotide polymorphism (SNP), single nucleotide variation (SNV) and copy number variation (CNV) have been used to diagnose diseases such as thalassanemia. Now Real-time-PCR, DNA sequencing and gene array have been used to detect nucleotide markers such as SNP, SNV and CNV. However, these techniques require nucleotide amplification and labeling, which may lead to higher false positive rate and lower repeatability. Leaky surface acoustic wave (LSAW) biosensors have higher sensitivity and donot require labeling, thus outweigh the above techniques. Since the concentration of SNP, SNV and CNV are very tiny in the peripheral blood, detection of these biomarkers without nucleotide amplification is the technology challenge in the field of biosensors. Based on the former research, we believe that the LSAW biosensors would be the promise to rise this technology challenge, if the sensitivity of the biosensors could be improved. In this proposal, we intend to design Polyacrylamide modified functional DNA nano-probes to develop the sensitivity of the LSAW biosensors through increasing both mass load and the liquid viscosity on the surface of the biosensors. At the same time, in order to ensure the stability of this biosensors, we plan to design a new insert type LSAW chip and corresponding micro-capacity detection system. Eventually, a new insert type LSAW biosensor technique will be developed for SNP, SNV and CNV detection. Further, the application value of this new technique in genetic detection of thalassanemia will be studied.

单核苷酸多态性（SNP）、单核苷酸变异（SNV）和拷贝数目变异（CNV）等标志物已被用于诊断地中海贫血等多种疾病。目前检测SNP、SNV和CNV的荧光定量PCR、DNA测序、基因芯片等技术，需扩增及标记，有假阳性且重复性差。漏声表面波（LSAW）生物传感器灵敏度高、无需标记，优于上述技术。由于外周血中SNP、SNV及CNV含量极低，因此实现它们的无扩增检测是生物传感器领域的攻关难点。基于前期研究，我们认为LSAW生物传感器灵敏性若能进一步提高，将最有希望突破该技术难关。本项目拟构建聚丙烯酰胺修饰功能DNA纳米探针，从增加LSAW传感器表面质量负载和溶液黏度两方面提高传感器敏感性。同时为保证检测体系的稳定性，我们拟设计新型倒插式LSAW芯片及微容量检测体系。最终建立一种适用于SNP、SNV和CNV无扩增同时检测的新型倒插式LSAW生物传感器技术，并探讨该技术在地中海贫血基因检测中的应用价值。

本研究成功制作了新型SH-LSAW传感器，明确了SH-LSAW传感器液相中的生物学反应规律，研制了SH-LSAW生物传感器微流控通道，优化了数据采集分析软件，在此基础上，搭建了新型多通道SH-LSAW生物传感器检测系统，并研制了第二代LSAW生物传感器检测仪。与此同时，通过将功能DNA纳米技术与制式连接探针技术有机结合，建立了用于地中海贫血基因检测的LDR-ULP检测技术和基于DNA正四面体探针微阵列技术。此外，通过设计3D打印微流控芯片和研发智能判读APP，搭建了基于RPA技术的Sample to Answer微流体传感器地中海贫血基因检测技术，实现了长片段缺失、短片段缺失、单碱基替换和单碱基插入的所有突变类型α，β地中海贫血的全覆盖检测。进一步，围绕功能DNA纳米技术，课题组通过将三臂“Y”型DNA与DNA纳米组装技术有机结合，成功构建了一种基于超分枝树状 DNA 的miRNA传感技术；通过催化发夹自组装与DNA网状结构结合，建立了一种无酶、双重信号放大的miRNA传感技术；通过DNA四面体与DNA分子镊子纳米机器整合，建立了一种基于DNA四面体分子镊子的miRNA在体可视化检测技术；将电化学生物传感器与RCA信号放大技术有机结合，构建了用于循环肿瘤细胞检测的适配子型电化学生物传感器检测技术。研究后期，将超材料生物传感器引入到生物医学检测领域，构建了双工频率管道超材料传感器，双谐振环对称结构超材料生物传感器，meta-LFICS生物传感器，并建立了基于超材料生物传感的生物分子检测技术，为临床生物标志物检测提供了新的平台。本课题综合利用SH-LSAW生物传感器技术、Sample to Answer微流体传感技术、电化学传感技术和超材料生物传感技术，结合功能DNA纳米材料，建立了具有高灵敏度、高特异性的生物传感器技术平台，实现了地中海贫血基因、miRNA、循环肿瘤细胞和蛋白标志物的快速、高灵敏检测，为临床疾病的早期诊断、患者预后及疗效评估提供了全新的方法。研究结果在国外SCI期刊发表论文12篇（总影响因子：83.965），国内CSCD期刊发表论文6篇，获得国家发明专利3项，获国家科技进步二等奖1项，军队科技进步二等奖1项。