γ疱疹病毒在细胞内组装释放原位动态的三维结构研究

Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV) belong to γ- herpesvirus subfamily, which cause malignant neoplasm. Viral lytic replication plays a critical role in viral tumorigenesis. Virion morphogenesis is an important event in the late stage of lytic replication. Much of the structural data published come from classical electron microscopy (EM), and a three-dimensional (3D) in situ structure visualization of virus assembly in the host is lacking, significantly limiting our understanding of the structural and molecular basis of virus-host interactions. Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is an important research method in structural biology and cell biology. The ability of Cryo-ET to visualize unique biological events in 3D makes its application to imaging macromolecules in their native cellular and subcellular context very attractive. In this project, we will use murine gammaherpesvirus 68 (MHV-68) as a model, target the virus assembly factory in the cytoplasm by Cryo-CLEM, fabricate vitreous lamellas by Cryo-FIB, and 3D reconstruct the fabricate samples by Cryo-ET. Our results will lead to a deeper understanding of the 3D structure of virus assembly factory in situ and the molecular mechanisms involved in virus-host interaction, and provide insights into developing new therapeutic approaches to prevent and control viral persistent infections.

γ疱疹病毒与人类恶性肿瘤密切相关，病毒复制对其致病性至关重要，而病毒颗粒组装释放是病毒裂解期复制的必要步骤。目前对病毒在细胞内组装释放过程的结构观察还停留在二维的传统透射电镜上，而人们对近生理状态下病毒组装释放原位三维结构的认识还较缺乏，这也就大大限制了我们对病毒-宿主相互作用过程中相关结构和分子机制的理解。冷冻电子断层成像（Cryo-ET）可以获得更真实和近天然的细胞内部高分辨率三维结构以及病毒-宿主相互作用原位结构信息，是结构生物学研究的重要手段。本项目将以鼠γ疱疹病毒68为模型，利用冷冻光电关联成像（Cryo-CLEM）技术对病毒在细胞质中组装释放区域（病毒组装车间）进行定位，利用冷冻聚焦离子束（Cryo-FIB）切割技术制备细胞含水切片，并进行电子断层扫描三维重构成像。研究结果将帮助深入认识疱疹病毒组装释放的原位三维结构及与宿主相互作用的分子机理，为防控病毒持续性感染提供理论依据。

γ疱疹病毒与人类恶性肿瘤密切相关，病毒复制对其致病性至关重要，而病毒颗粒组装释放是病毒裂解期复制的必要步骤。目前对病毒在细胞内组装释放过程的结构观察还停留在二维的传统透射电镜上，并且使用传统的透射电镜样品制备方法致使很多结构形态的分子细节被破坏，而人们对近生理状态下γ疱疹病毒组装释放原位三维结构的认识还较为缺乏，这也就大大限制了我们对病毒-宿主相互作用过程中相关结构和分子机制的理解。. 我们对鼠γ疱疹病毒68基因组BAC进行荧光标记，制备病毒感染的细胞冷冻样品，利用冷冻光电关联成像技术对病毒在细胞质中组装释放区域（病毒组装车间）进行定位，然后利用冷冻聚焦离子束切割技术制备细胞冷冻含水切片，进行冷冻电子断层扫描成像，并收集系列倾转角度的冷冻电子断层成像数据，通过三维重构得到数据重构体。我们在细胞原位分别观察到了细胞核内的衣壳，初级囊膜化的病毒，在内质网腔中运输的病毒，病毒粒子的间质化过程、二次囊膜化过程，以及包裹在囊泡中的成熟病毒粒子。我们所得到的这些结果中病毒组装释放的原位细节更加清楚，其次我们发现病毒二次囊膜化过程中在衣壳外面所形成的一圈间质层是一有序的结构，另外我们发现“病毒组装车间”这一区域富含脂滴、大量核糖体、多层膜等结构。. 这些研究结果将帮助我们深入认识疱疹病毒组装释放的原位三维结构及与宿主相互作用的分子机理，为防控病毒持续性感染提供理论依据。