谷氨酸棒杆菌分支链氨基酸代谢网络比较分析及动态调控研究

Corynebacterium glutamicum is one of important industrial strains. Inadequate understanding of metabolic network dynamic regulation limits the deeper application of metabolic engineering. Branched chain amino acids (valine, leucine and isoleucine) are good candidates for comparative studies of metabolic network regulation, since these three amino acids have many similarities and differences in the synthetic pathway and regulation. In previous study, applicants bred three amino acids producing strains using a same original strain as the parent. The genome of original strain and mutant strains were all sequenced. In this project, we will carry out comprehensive comparative analysis of gene sequences, transcription, enzyme properties and metabolic flux in original strain and mutant strains, in order to look for more key factors related to metabolic network and understand corresponding regulation mechanism. Furthermore, we will conduct perturbing analysis of the key factors affecting metabolic network by genetic engineering technology. By comparatively analyzing changes and differences of different strains of metabolic networks by single factor and multi factor disturbance, we will thereby resolve more key factors and collaborative mechanisms for metabolic network synergism. Therefore, our program will not only help to understand more important mechanisms of metabolic network, synergism and regulatory, but also provide important reference and practice guidance for C. glutamicum metabolic engineering research including branched chain amino acid products.

谷氨酸棒杆菌是重要的工业菌株，但目前对其代谢网络动态调节认识的不足限制了更深层次代谢工程应用研究的进展。分支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）在代谢途径和调控方面具有很多异同，可作为代谢网络和调控研究的优良素材。前期研究中，申请人以同一亲本出发，选育出三种分支链氨基酸生产菌，并完成了出发菌和突变株的全基因组测序。本项目将对四株菌代谢网络关键基因序列、转录水平、酶性质和代谢流等多因素进行全方位的比较分析，挖掘更多与代谢网络相关的重要因素，解析相应的代谢机理。通过基因工程手段，对代谢网络的关键因素进行基因扰动，分析比较单因素和多因素组合扰动对不同菌株代谢网络产生的变化和差异，解析更多代谢网络协同作用的关键因素及协同机理。项目研究对于加深谷氨酸棒杆菌代谢分子基础、互作关系及调控机制理解具有重要意义，同时为包括分支链氨基酸产品在内的更多谷氨酸棒杆菌代谢工程应用研究提供重要参考和实践依据。

分支链氨基酸在医疗、保健和饲料等众多领域都具有重要的应用价值。本研究通过结合比较基因组学、转录组学和代谢组学研究手段，对分支链氨基酸生产突变株XV和CP的产酸机制进行分析，并对突变株与标准株之间的遗传信息和细胞生长代谢特征进行了比较。具体内容主要包括以下几个方面：.（1）比较基因组学分析结果表明，两株突变株与谷氨酸棒杆菌标准菌株具有较近的亲缘关系。在基因序列差异分析中，发现突变株的糖酵解途径、磷酸戊糖途径、丙酮酸代谢途径以及部分氨基酸副产物合成途径中存在大量差异基因，这些基因序列的差异可能有助于减少相关副产物合成。（2）转录组学分析结果表明，在丙酮酸代谢、柠檬酸循环和乙醛酸循环相关的基因中，突变株的大部分基因转录水平显著上调，其主要原因可能是由于胞内丙酮酸浓度处于较低水平，从而导致下游代谢途径通过上调相关基因的表达水平来提升对底物丙酮酸的竞争能力。（3）胞内代谢物浓度分析表明，在中心碳代谢中，突变株的磷酸戊糖途径比糖酵解途径更为活跃，成为了6-磷酸葡萄糖的主要代谢途径。突变株的胞内丙酮酸浓度以及柠檬酸循环所涉及的多种有机酸的胞内浓度显著低于标准株，表明突变株的碳代谢强度较低。（4）在标准株中表达来源于XV的乙酰乳酸合酶编码基因ilvBNXV，L-缬氨酸产量提高到23.91 g/L，较出发菌株提高16.69%，并且菌株获得了在以柠檬酸为唯一碳源的基本培养基中生长的能力。在缬氨酸菌株基础上，过表达leuACP和leuBCD操纵子， L-亮氨酸产量达到13.09 g/L。此外，发现了CP_2836基因的PCP_2836启动子的转录强度在稳定期较指数期显著下降，利用该启动子别替换aceE和gltA基因的启动子，L-缬氨酸产量分别提高了23.9%和27.3%，糖酸转化率分别提高了40.3%和56.8%。.本研究对于加深谷氨酸棒杆菌代谢调控和遗传机制的认识和理解具有重要意义，同时还为分支链氨基酸生产菌株性能的进一步提升，以及相关的谷氨酸棒杆菌研究工作的开展，提供了重要的理论支撑。