肿瘤射频消融对CIK细胞体内迁移与抗肿瘤活性的影响与作用机制

Radiofrequency ablation (RFA) is a rapidly developing minimally invasive treatment for cancer. Tumor ablation produces in situ tumor antigens, and elicites speci?c immune responses with a dense immunocyte infiltrate in tumor. But it is not cleary whether the RFA-induced immunostimulation can promote adoptive immune cells migrating into tumor site and enhance the anti-tumor immune response. .Cytokine induced killer cells (CIK cells) represent one of the promising adoptive cellular immunotherapies. Our preliminary studies suggest that adjuvant CIK cells therapy after RFA can prolong the survival time of the patients with hepatocellular carcinoma. In this study, we plan to evaluate the strenght of immune response in tumor-bearing mice after single or combined treatment of RFA and CIK cells, and visualize the trafficking of CIK cells in vivo utilizing bioluminescent imaging. At the same, we will screen the chemokines up-regulated expression in tumor microenviroment after RFA and the chemokine receptor expressed on CIK cells by protein chip technology, RT-PCR, double-color immunofluorescence analysis and flow cytometry, then study the chemokine/chemokine receptor mediated chemotaxis via chemotaxis experiments. Through the serial experiments, we will confirm the impact of tumor RFA on the migration and anti-tumor activity of CIK cells in vivo and the time window of interaction, and identify the chemokine/chemokine receptor signaling pathway that influence CIK cells directional migration after RFA. This study will provide a new theoretical basis for the combined treatment of RFA and CIK cells.

射频消融(RFA)是一种发展迅速的肿瘤微创治疗手段，消融后肿瘤抗原暴露，诱发特异性抗肿瘤免疫反应，刺激机体免疫细胞向瘤内浸润。但消融诱发的免疫刺激能否诱导过继性免疫细胞向瘤内迁移、使之进一步活化而获得更大抗瘤效应尚未明确。.细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是一种具有应用前景的过继免疫细胞。课题组前期研究发现RFA联合CIK治疗可延长肝癌患者的生存期。本项目拟采用分子生物学技术研究RFA与CIK单独或联合治疗荷瘤小鼠后所产生的抗肿瘤免疫效应；利用生物发光成像技术观察CIK在体内的动态分布；通过蛋白芯片、RT-PCR、双色免疫荧光等技术筛选出CIK定向迁移可能依赖的趋化因子与趋化因子受体，并设计趋化实验进行验证。该课题将明确RFA对CIK体内迁移与抗瘤活性的影响与两者作用的时间窗，并阐明RFA影响CIK迁移所依赖的趋化因子信号通路，为消融联合CIK治疗恶性肿瘤提供新的理论依据。

射频消融（RFA）是一种应用广泛的肿瘤微创治疗方法。研究表明RFA能激活肿瘤抗原特异性T细胞免疫应答。然而，消融所致的免疫反应不足以阻止肿瘤的复发。 .一．射频消融联合CIK细胞协同抗肿瘤作用的实验研究：.建立BALB/c小鼠结肠癌(CT26)皮下种植瘤RFA治疗模型，获取原位裂解的肿瘤组织反复冻融后取上清，利用上清液负载培养骨髓来源的DCs获得Ag-DC，利用获得的DC与脾脏来源的CIK细胞共育后获得Ag-DC-CIK，分析CIK细胞体外杀与体内抗肿瘤活性。结果显示，RFA裂解物能刺激DC表面CD11c、MHC-II、CD80与CD86的表达，致敏的DC与CIK细胞共育能增强CIK细胞的抗肿瘤活性，并能显著抑制CT26移植瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存时间。. 其后利用小鼠双侧背部皮下移植瘤模型，证实局部RFA联合CIK治疗显著抑制对侧肿瘤生长，并延长小鼠生存时间；对侧肿瘤内CD8+、CD4+T、NK 和 NKT 细胞数量均显著增加；CD8+/Treg比值增大，髓源性抑制细胞比例降低；RFA联合CIK组对侧肿瘤内外源性CIK细胞聚集增加；Ki-67、 ICOS与颗粒酶B的表达水平上调。结果提示RFA治疗可促进CIK细胞向消融区外肿瘤内迁移，并提高CIK细胞在肿瘤内增殖能力与活性，从而产生协同抗肿瘤作用。.二．射频消融与PD-1单抗的协同抗肿瘤作用：.通过建立小鼠双侧背部移植瘤模型，以及对结直肠癌肝转移患者的病例对照研究发现，RFA能在远处肿瘤内激活T细胞免疫反应，但仅能产生短暂的肿瘤抑制作用。进一步的免疫分析发现，RFA激活T细胞免疫应答的同时诱导了适应性免疫抑制形成，表现为：消融后期肿瘤浸润T细胞活化后失能、 Treg扩增、PD-1/PD-L1表达上调。在小鼠结肠癌移植瘤模型中证实RFA联合PD-1单抗阻断能增强T细胞免疫应答，并阻止 T细胞（Teff）向Treg转化；两者联合应用对消融区外显著抑制肿瘤生长，并显著延长小鼠生存时间。结果提示PD-1/PD-L1是介导RFA后免疫抑制形成的重要因素。该研究并为开展RFA与PD-1/PD-L1单抗治疗的临床研究提供了理论依据。