细胞表面蛋白介导乳酸菌絮凝淀粉机制及其对淀粉加工性质的影响

The traditional technology with naturally fermented sour liquid mainly used for the production of sweet potato starch and mung bean starch has hundreds of years, which starch gained an extensive application in vermicelli processing for its unique character. However, there are a large number of bacteria and organic compounds in the discharged wastewater, which seriously cumbers the technology wide application in starch processing. The protein mediating the adhesion to starch is to be separated and purificated from the Lactobacillus paracasei subsp. paracasei L1 with high flocculating activity on base of the microbiological study of sweet potato sour liquid. Then, starch-binding protein of L1 is as the research object and identified by mass spectrometry. Starch-bingding properties, spatial structure and starch-bingding sites of the protein are then studied to reveal the molecular mechanism of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei L1 adhesion to starch. Fanally, the crystal structure and chemical composition and character of starch adhered by protein are studied to reveal the effect of protein on the starch. Therefore, this study is beneficial to the development of flocculant for starch and the wide application of sour liquid technology in special starch for processing vermicelli.

微生物发酵酸浆法絮凝淀粉主要在甘薯和绿豆淀粉生产中应用，是我国民间传统工艺，该技术的特点是淀粉经微生物絮凝后，粉丝加工性质得到明显改善，是粉条类产品加工的优质原料。但是，近年来，由于该工艺排放的废水中含有大量乳酸菌活细胞造成环境污染，且淀粉改性的机制也不明确，严重限制了酸浆法技术的推广应用。本项目将在甘薯酸浆微生物学研究的基础上，以筛选到的、高絮凝活性的副干酪乳杆菌L1为研究对象，分离纯化位于菌体细胞表面的絮凝因子--淀粉结合蛋白，以絮凝率为指标，研究蛋白质与淀粉的结合条件，确定蛋白质脱离菌体后对其絮凝淀粉活性的影响；同时，利用质谱、生物信息等技术鉴定、预测蛋白质结构及淀粉结合位点，从蛋白质分子水平上阐明乳酸菌与淀粉结合机制；并在此基础上，通过扫描电镜、X射线衍射等研究该结合作用对于淀粉结构及加工性质的影响，为淀粉絮凝剂的开发应用和酸浆法技术生产粉条专用淀粉奠定理论基础和提供技术支撑。

本项目按照申报要求完成了三部分实验内容：（1）通过宏基因组技术确定了乳杆菌属为自然发酵甘薯酸浆中发挥絮凝淀粉的优势作用菌。以分离到淀粉絮凝菌——副干酪乳杆菌为研究对象，通过盐酸胍法提取菌体表面淀粉结合蛋白，聚丙烯凝胶酰胺将其分离纯化，通过LC-MS/MS液质联仪鉴定，结果鉴定出60多种淀粉结合蛋白，Macsot Score≥100的蛋白有10种，其中4种含量较高的蛋白都是与糖代谢有关的酶；值得注意的是这些淀粉结合蛋白同样在鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌等益生性乳酸菌表面存在，而且在与寄主粘附中发挥重要作用。通过Zeta电位分析、物理化学试剂处理分析等试验，确定淀粉结合蛋白是通过特异性结合促进乳酸菌结合到淀粉颗粒表面，将淀粉颗粒连接成大的絮凝体，加速淀粉沉降。（2）分别考察了淀粉结合活性对副干酪乳杆菌代谢淀粉能力的影响和具有絮凝活性的副干酪乳杆菌发酵后的淀粉理化及粉丝加工性质的变化。结果发现淀粉结合活性能够显著促进乳酸菌对淀粉的代谢，经过副干酪乳杆菌发酵后的淀粉可以显著改变淀粉的化学成分、直链淀粉含量、淀粉老化速率、黏度及其溶解度和膨润力，这为乳酸发酵改善淀粉的粉丝加工性质提供了理论依据。（3）以甘薯淀粉废水、玉米淀粉废水和绿淀粉废水为发酵原料，利用分离到的高淀粉结合与代谢活性的乳酸菌发酵甘薯汁饮料、玉米汁饮料和绿豆汁饮料。. 乳酸菌与淀粉结合机制的揭示为淀粉专用絮凝剂的开发、酸浆法技术的推广应用、乳酸菌的淀粉结合特性在食品领域中更好、更广泛的应用奠定理论基础。本项目执行过程中申报了4项国家发明专利，其中1项授权专利已经在锦州益多乐乳业有限公司产业化应用。同时，培养硕士研究生7人，发表科研论文9篇。