125I-PQ3增强TFO对人肝癌细胞生长抑制效应的实验研究

申请者在前期研究中发现：125I标记的与HBV前s基因特异结合的三链形成寡核苷酸（125I-TFO）可以与靶dsDNA形成三链DNA结构，并可抑制整合有完整HBV基因的 HepG2.2.15细胞的生长及其HBsAg、HBeAg的合成。但同时发现其形成的三链DNA结构稳定性低，影响125I-TFO胞内表达。为进一步研究，本课题拟采用一种吖啶奎宁类物质PQ3，首先使TFO结合于靶dsDNA形成三链结构，然后引入PQ3，与TFO－靶dsDNA三链中的靶位点特异性结合。这样不仅可以增加TFO结合稳定性，而且使125I更有效地结合于靶位点，达到对靶基因辐射的目的，并可减少125I标记TFO的复杂性；同时PQ3的光诱导断裂dsDNA效应可以与125I-TFO协同作用抑制HBV复制以及肿瘤细胞生长。这一研究模式对发展放射基因治疗具有重要的实际意义。

（1）以125I标记TFO，形成标记化合物125I－TFO，然后利用PQ3的三链特异选择性，使其特异性嵌入[TFO-靶dsDNA]三链结构中，对比分析不同方式下[125I-TFO-PQ3-靶dsDNA、TFO-PQ3-靶dsDNA、125I-TFO-靶dsDNA、TFO-靶dsDNA]，对靶HBV－DNA的切割作用、转染后对HepG2.2.15细胞的生长抑制作用以及诱导细胞凋亡效应；分别在基因复制水平、蛋白表达水平以及细胞生长水平比较分析各组情况。.（2）比较分析各种条件下三链DNA形成的热力学参数，TFO与靶序列结合的亲和力结合常数(Ka)、解离常数(Kd)及自由能变化(△G)以及辐射剂量-效应评价。.（3） 通过在体实验，将各转染组和对照组的HepG2.2.15细胞，接种于BALB/c裸鼠，比较观察成瘤速度，计算肿瘤生长参数，检测增殖细胞抗原PCNA表达和瘤细胞凋亡率。