利用代谢组学鉴定苏云金素合成途径中关键前提物和关键酶功能

本研究拟在已经获得的研究成果上，运用代谢组学的方法鉴定苏云金素合成途径中的关键前体物，关键酶的功能，最终确立苏云金素的合成途径。在本研究小组前期工作的基础上（成功克隆苏云金素合成基因簇及推导其合成途径），构建一系列关键酶缺失苏云金素高产菌株CT-43突变株，提取突变株及野生株的总代谢物，利用HPLC-MS以及时间飞行质谱，鉴定代谢物的积累，从而鉴定关键酶的底物，同时结合饲喂法，鉴定关键酶的产物，进而确立关键酶的功能，最终确立苏云金素的合成途径。研究成果理论上提供一种新的核苷类抗生素生物合成的信息，为其它核苷类抗生素的研究提供一个成果的范例，并为进一步对其进行合理化改造，获得一系列新型高效低毒杀虫素提供实验数据；应用上能为苏云金素的开发应用奠定坚实的理论和技术基础，能为我国农用杀虫素库增添新品种。能在国家发展安全农药、绿色农业和环境保护等方面取得较大经济效益和社会效益。

苏云金素是由某些苏云金芽胞杆菌产生的小分子量杀虫活性物质（701kDa）,属于核苷类抗生素。苏云金素具有广谱性、低毒性、热稳定性好、降解慢等特点。本研究小组在前一个青年基金的支持下首次成功克隆得到了苏云金素高产菌株CT43完整的苏云金素合成基因簇并推导了苏云金素合成途径。为了验证苏云金素的合成途径，在前期工作的基础上，本研究通过体内敲除回补及体外酶活实验，确定thuE是通过磷酸化前体物C获得具有活性的苏云金素。thuE突变株BMB0545和野生株CT-43的上清液和胞内代谢物分别进行了LC-microTOF和LCMS-IT-TOF飞行质谱实验，质谱结果显示thuE基因中断后，上清液中没有了苏云金素的m/z值，胞内代谢物的m/z值证明了所有前体物的存在，并且突变株BMB0545胞内前体物C发生了积累。通过纯化的ThuE蛋白催化前体物C合成苏云金素验证了ThuE的酶学功能。在苏云金素合成基因簇内部，有一个非核糖体肽同源蛋白Thu2，推测其为苏云金素合成的载体蛋白。体内敲除回补实验确证thu2是苏云金素合成必需基因。thuF编码一个糖基转移酶，本研究通过体内敲除回补实验验证了thuF为苏云金素合成必需基因。序列分析发现在Thu合成基因簇附近含有virB4、virB11及virD4等类IV型分泌系统(Type IV secretion systems, T4SSs)相关基因，推测其可能与Thu的分泌相关,通过敲除virD4证实其与苏云金素的分泌相关。. 对具有新型抗生素结构中关键基因功能的阐释将为抗生素领域的组合生物学和合成生物学提供指导。本研究小组的研究成果能为苏云金素和相关抗生素的开发应用奠定坚实的理论和技术基础，能在国家发展安全农药、绿色农业和环境保护等方面取得较大经济效益和社会效益。