杜仲种子α-亚麻酸合成及高效积累的分子机制研究

Eucommia ulmoides Oliver, an important multi-purpose economical tree species, contains α-Linolenic Acid (ALA) of over 60% in its seeds. But the molecular mechanism on synthesis and high-level accumulation is unclear. Based on screening of 15 different ALA content E. ulmoides clones, in this project, the regulation mechanism of EuFAD3 on ALA synthesis will be clarified by EuFAD3 cloning, members detection of EuFAD3 family, subcellular localization, expression sites detection, expression patterns, and correlation analysis. The role of EuDGAT and EuPDAT in 18:3 accumulation in TAG will be determined by EuDGAT and EuPDAT gene cloning, transformation to yeast mutations, and isotope assay. High ALA content arabidopsis lines will be screened by identification of EuFAD3 gene plays a key role in ALA synthesis, multi-genes co-transformation to arabidopsis, and fatty acid analysis. The regulation mechanism of high accumulation of ALA in seeds on molecular level will be finally eluciadated. Our results will be useful for clarification of ALA synthesis mechanism in other oil crops, and can provied important theoretical basis for new species breeding with high ALA content.

杜仲是我国重要的多用途经济林树种，杜仲籽油中α-亚麻酸含量可达60%以上，但α-亚麻酸合成及高效积累的分子机制并不清楚。本项目在获得高、中、低α-亚麻酸含量的杜仲无性系实验材料基础上，通过杜仲EuFAD3同功酶基因家族成员的克隆、鉴定，亚细胞定位及表达的准确部位的检测，种子不同发育阶段EuFAD3基因的表达模式与α-亚麻酸积累的关联分析等，解析EuFAD3基因对α-亚麻酸合成的调控机制；通过克隆杜仲EuDGAT和EuPDAT基因，转基因酵母缺失突变体，同位素标记等，确定EuDGAT和EuPDAT酶对α-亚麻酸底物选择的特异性；通过EuFAD3、EuDGAT和EuPDAT多基因转化拟南芥，筛选α-亚麻酸高含量株系，最终揭示出杜仲种子α-亚麻酸合成及高效积累的分子机制。研究结果可为高α-亚麻酸含量的植物新种质创制提供重要的理论基础和技术支撑。

杜仲是我国重要的多用途经济林树种，杜仲籽油中α-亚麻酸含量可达60%以上，但α-亚麻酸合成及高效积累的分子机制并不清楚。本项目在获得不同α-亚麻酸含量的杜仲无性系实验材料基础上，通过杜仲EuFAD3同功酶基因家族成员的克隆、鉴定、亚细胞定位、准确表达部位的检测、以及在种子不同发育阶段中的表达模式与α-亚麻酸积累的关联分析等，解析EuFAD3基因对α-亚麻酸合成的调控机制；通过对EuFAD3遗传转化，筛选α-亚麻酸高含量株系，最终揭示出杜仲种子α-亚麻酸合成及高效积累的分子机制。主要研究结果如下：（1）建立了世界上最大的基因库，收集保存国内外杜仲资源1300余份，利用表型数据构建了46 份杜仲雌株核心种质。连续3年对基因库中雌株进行油脂成分及α-亚麻酸含量检测，筛选出高产优质亚麻酸优良无性系6个，审定河南省良种3个；获得植物新品种权2个。（2）连续3年对不同时期杜仲种仁脂肪酸成分进行分析，呈现缓慢增长，无剧烈变化。确定花后70d左右种仁结束快速生长期。（3）开展杜仲种仁转录组测序，得到96,469条Unigene，38,983条Unigene获得生物功能注释，包含9,621个完整的SSR位点。（4）首次克隆得到杜仲FAD3基因家族，其中FAD3-1 cDNA 全长1,281 bp，基因组DNA全长3,151 bp，有8 个内含子，启动子2,038 bp； EuFAD3-2 cDNA 全长1,347 bp，基因组DNA全长1,347 bp，无内含子；启动子2,201 bp。两个FAD3 基因均定位于内质网。（5）确定FAD3-1 基因在‘华仲6 号’和‘华仲10 号’种仁发育过程中均是先上升后下降，花后110 d 和150 d达到最大值；FAD3-2 基因在‘华仲6 号’种仁发育过程中先上升后下降，后又上升，并在花后110 d 达到最大值； FAD3-2 基因在‘华仲10 号’种仁发育过程中先下降后上升至最大值（花后100 d），又下降。相同时期FAD3-1表达量明显较高。（6）FAD3-1和FAD3-2转化烟草种子中α-亚麻酸的含量增加了4.27%和0.92%，亚油酸的含量降低了3.86%和0.65%，其他脂肪酸变化不显著。FAD3-1 转基因烟草种子中α-亚麻酸的含量要远高于FAD3-2的。该研究的实施为高α-亚麻酸含量的植物新种质创制提供重要的理论基础和技术支撑。