tet(A)突变体基因在替加环素耐药CRKP中的作用与传播机制研究

Carbapenem-resistant Klebsiellapneumoniae (CRKP) are increasingly isolated, being potent challenge for anti-infection treatment. Tigecycline is the first choice for CRKP infections, however, the resistance rate is ascending. Recently, tet(A) variants, coding for tetracycline efflux pump, were associated with tigecycline resistance. Our preliminary experiments found an increasing trend of tet(A) variants in CRKP isolates, whether tet(A) mutant-carrying CRKP isolates will be popular needed further investigation. The current study will focus on tet(A) mutant-carrying CRKP isolates which demonstratedistinct susceptibility towards tigecycline, comparative genomics analysis will be conducted to investigate the regulatory genes and mobile elements which was closely related to tet(A) variants, additionally, gene knockout and complementation assay will be applied for function validation; furthermore, fitness cost and epistatic effect assay will be performed to reveal the evolutionary process of tet(A) variants among CRKP isolates, to predict the possibility of transmission of tet(A) mutant-carrying CRKP isolates in clinical practice. Our study will provide strategic supports for prevention and control of tigecycline resistance among CRKP isolates.

碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌（CRKP）在临床分离率逐年升高，已成为抗感染领域的一大难题，替加环素作为对抗CRKP感染的首选药物，耐药率不断攀升。最近研究表明四环素外排泵基因tet(A)突变与替加环素耐药密切相关。本课题组在前期研究中发现tet(A)变异体在CRKP临床分离株中的检出率迅速增高，携带tet(A)变异体的CRKP是否会流行播散，亟需更多深入研究。本研究拟以前期收集的不同耐药表型的tet(A)突变CRKP菌株为研究对象，利用比较基因组学分析方法探究tet(A)变异体相关的调控基因和可移动元件，同时应用基因敲除和回补实验验证其功能，阐明其在替加环素耐药机制中的作用；进一步通过适应性代价和异位显性效应研究，揭示tet(A)突变的CRKP替加环素耐药进化历程，预测携带tet(A)变异体的CRKP菌株在临床上发生流行传播的可能性，为CRKP菌株替加环素耐药控制策略提供依据。

日益出现的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae， CRKP）使得临床抗感染治疗极为受限。2011年10月在我国批准上市的替加环素成为临床治疗CRKP感染的首选抗菌药物。2019年课题组收集了人群和动物的1843份样本，其中人样本1743份，动物(牛)样本100份，共获筛选到345个阳性菌株，其中四环素耐药的334株（334/345；96.8%），替加环素耐药的4株（4/345；1.15%），对tet(A)阳性菌株进行了突变类型分析。另外，课题组对完成了2016-2020年间2594株CRKP的全基因组二代测序，生物信息学分析发现其中tet(A)阳性菌株621株。其中1型变异体占90.7%，另有2型变异体6.8%及未知类型的突变体2.5%。我们从其中挑选了一株tet(A) 1型变异体阳性CRKP代表性菌株KP1508进行了较为深入的研究，发现其属于ST11型blaKPC-2阳性肺炎克雷伯菌，其血清型为K64。tet(A) 1型变异体位于一164,141 bp的IncFIB/FIC型的多重耐药质粒pKP1508-tetA上，除tet(A) 1型变异体外，还携带sul2、strAB、mph(A)、sul1、blaCTX-M-65、aac(3)-IId、blaTEM-1B等耐药相关基因。该质粒携带一系列接合转移相关元件（tra基因簇），提示其可通过质粒接合进行水平转移。2020年课题组从同一患者的不同标本分离到2株CRKP，其中KP-426菌株对替加环素中介（MIC值4 μg/ml），KP-CT77菌株则呈高水平耐药（MIC值32 μg/ml）。全基因组测序和分析发现，两株CRKP具有高度同源性，携带的耐药基因也完全相同，仅tet(A) type 1变异体存在一个碱基的差异，该碱基突变导致了Tet(A)蛋白第300位甘氨酸突变为谷氨酸，即G300E。研究结果显示G300E突变可大幅度提高tet(A) type 1变异体对替加环素的耐药水平。在上述基础之上，课题组还对动物和人体肠道中替加环素耐药基因tet(X)进行了初步研究，解析了介导多重耐药的可转移新型RND型外排泵TMexCD-TOprJ的临床分布，为课题的后续全方位的研究替加环素耐药基因在CRKP中的传播和耐药奠定了研究基础。