组织工程化口腔黏膜中应力推挤角化细胞移位形成上皮钉突样结构的研究

The current fabricated tissue engineered oral mucosa equivalents usually lack rete ridges, and their epidermis are apt to detach from the scaffold after clinical application. Our previous research suggested mechanical stresses stimulated the proliferation of the transient amplifying cells,and it produced inner stresses that pushed the neighbor basal keratinocytes migration towards the lamina propria, while the extracellular matrix was degraded by the simultaneously secreted MMPs, herein, the rete ridge has been formed, and ERK, AKT and PC cascades played important roles in these processes..This project aims to fabricate a tissue engineered oral mucosa equivalent which endowed with rete ridge-like structure, the employed resolution is to simulate the cellular and biological processes of rete ridge morphogenesis in vitro. This project has 3 parts: ⅰ)The correlation between the expression level of the key factors in the ERK, AKT, PC cascades and the produced inner stresses of the oral keratinocytes.ⅱ) To construct a tissue engineered oral mucosa equivalent with genes transfected keratinocytes under stresses loading circumstance. ⅲ)In vivo transplantation of the tissue engineered oral mucosa equivalents onto the palatal wounds of the SCID mice..Our fabricated tissue engineered oral mucosa equivalents will have rete ridge-like structure,and this microtopography would enhance the adherence between the epidermis and scaffold.

当前构建的组织工程化口腔黏膜多缺乏上皮钉突样结构，临床应用时其上皮细胞层易与支架分离。本课题组前期的研究提示：在外界应力刺激下，口腔黏膜上皮棘细胞层中瞬时增殖细胞分裂增殖加速，产生的内应力推挤基底层干细胞向黏膜固有层移位，同时分泌MMP降解细胞外基质，上皮钉突由此形成，ERK、AKT和PC等信号通路参与其间的调控。.本课题拟通过加压载荷、基因转染等技术，在体外模拟上皮钉突形态发生过程中的细胞生物学事件，构建含上皮钉突样结构的组织工程化口腔黏膜。研究内容包括：①角化细胞内ERK、AKT和PC等信号通路中关键因子的表达水平与细胞内应力大小的关联；②加压载荷条件下，将转染有erk、akt和pc等基因的角化细胞用于构建组织工程化口腔黏膜；③组织工程化口腔黏膜回植至SCID鼠腭部的研究。.本研究构建的组织工程化口腔黏膜可能具有上皮钉突样结构，为增进其上皮细胞层与支架之间的粘附力提供新的解决方法。

当前构建的组织工程化口腔黏膜缺乏上皮钉突样结构，应用时上皮细胞易于基质分离。本课题组前期的研究提示：在外力刺激下，口腔上皮棘层细胞中的瞬时增殖细胞分裂增殖加速，产生的内应力推挤基底层干细胞向黏膜固有层移位，同时分泌MMP降解细胞外基质，上皮钉突由此形成。由此，本资助项目进行如下实验研究：1.MMP2和MMP9在口腔黏膜上皮钉突形态发生过程中表达：采用免疫组织化学染色方法检测口腔黏膜上皮钉突形态发生过程中MMP2、MMP9的表达表达水平。结果表明MMP2在上皮钉突形成过程中的表达水平显著提高，而MMP9在口腔黏膜上皮钉突形态发生过程中的表达水平无显著变化，提示MMP2可能是上皮钉突形态发生过程中关键的基质金属蛋白酶。2.ERK1/2在口腔黏膜上皮钉突中的表达：采用免疫组织化学染色方法检测不同黏膜类型中ERK1/2、Ki67及CK19（上皮干细胞标志分子）的表达水平及分布特点。结果表明ERK1/2、Ki67在咀嚼黏膜（钉突较长）的表达水平明显高于其在衬里黏膜（钉突较短）的表达（P<0.05），CK19在咀嚼黏膜的表达与其在衬里黏膜的表达水平无显著差异。3.静压力促进口腔黏膜上皮细胞ERK1/2活化：采用聚四氟乙烯圆柱体0.9g/cm2、1.5g/cm2、2.7g/cm2的重量分别作用于十二孔板内的角化细胞，各组依次加载7min、14min、21min、28min，结果显示在静压力作用下，ERK1/2的活化水平显著提高。 4.白细胞介素（IL）-6促进口腔黏膜上皮钉突伸长及机制研究：于2月龄昆明小鼠舌腹注射不同浓度IL-6，2、4周后检测上皮钉突的形态学变化，并于体外培养人口腔黏膜角化细胞，探讨IL-6促进上皮钉突延长的分子机制。本资助项目首次证实口腔黏膜上皮细胞在口腔黏膜上皮钉突形成过程中可以分泌基质金属蛋白酶MMP2，降解黏膜固有层基质，可能为上皮细胞向结缔组织迁移创造条件。静压力可导致口腔黏膜上皮细胞中ERK1/2活化，引起局部细胞的增殖和迁移；在口腔黏膜上皮钉突形成过程中则促使口腔黏膜上皮细胞向结缔组织迁移。该研究结果为生产含上皮钉突样结构的组织工程化口腔黏膜提供了指导意义。