TLR4通过抑制WNT信号通路促中耳胆脂瘤过度角化及骨质破坏作用机制研究

Cholesteatoma is an inflammatory disease characterized by hyperplasia of keratinocyte and bone destruction. Earlier studies found t that bacterial infection and its inflammation promote hyperproliferation of cholesteatoma and bone destruction，which mediated by TLR4. However, what is the mechanism of bone destruction in cholesteatoma mediated by TLR4. Preliminary experiment showed that infection may activate epidermal progenitor cells which are inclined to hyperproliferation and hyperkeratosis. WNT Signaling pathway participates in cell proliferation and differentiation. But it remains unclear about the role of WNT Signaling pathway in cholesteatoma. Further experiment show that expression of WNT7A in cholesteatoma is significantly lower than skin，what’s more, K1 is upregulated and K3 is downregulated when hacat cells are stimulated with WNT7A. This result suggest that WNT7A suppress the differentiation from epidermal progenitor cells to keratinocyte. In addition, WNT7A inhibit the activation of osteoclast through keratinocyte. It is reported that WNT Signaling pathway can interact with TLRs. So, is Wnt Signaling pathway regulated by TLR4 in cholesteatoma? Preliminary experiment showed that TLR4 downregulated the expression of WNT7A. So, we propose a hypothesis that TLR4 suppress Wnt Signaling pathway to promote differentiation from epidermal progenitor cells to keratinocyte, then activate osteoclast which lead to bone destruction. This study will reveal the role of TLR4/WNT in cholesteatoma bone destruction by experiments in vivo and in vitro, and provide experimental evidence for the molecular mechanism of bone destruction in cholesteatoma

中耳胆脂瘤是以角化上皮细胞过度增殖和骨质破坏为特征的炎性疾病。前期研究证实细菌感染及TLR4介导的炎症反应促进中耳胆脂瘤增殖和骨质破坏。那么，TLR4如何介导胆脂瘤骨质破坏呢？预实验表明感染可激活中耳胆脂瘤的表皮定向祖细胞。WNT信号通路参与细胞的增殖分化，但对胆脂瘤作用不明。进一步预实验表明WNT7A在人中耳胆脂瘤中表达显著降低，其刺激Hacat细胞后，可显著降低K1、上调K3的表达，提示WNT7A可抑制上皮定向祖细胞向角化细胞分化，此外，WNT7A亦抑制角化细胞激活破骨细胞。文献报道WNT信号通路与TLR存在交互作用。预实验显示TLR4可抑制WNT7A的表达。因此我们提出“TLR4负调控WNT信号通路而促胆脂瘤中的表皮定向祖细胞向角化细胞分化，破骨细胞激活而致骨质破坏”的假说。本课题将通过体内外实验揭示TLR4/WNT在胆脂瘤骨质破坏中的作用，为明确其骨质破坏的分子机制提供实验依据

中耳胆脂瘤是以角化上皮细胞过度增殖和骨质破坏为特征的炎性疾病。随着分化程度的不同，角化细胞表达不同的角蛋白，因而角蛋白可作为干细胞、定向祖细胞以及分化细胞的鉴别手段。表皮干细胞表达K19，定向祖细胞表达K5和K14，而分化的终末细胞则表达角蛋白K1和K10。我们研究发现中耳胆脂瘤中存在大量Keratin5 /Keratin14（K5/K14）阳性细胞。提示中耳胆脂瘤存在大量表皮定向祖细胞，因此具有过度增殖和定向分化能力。WNT7A信号通路在介导皮肤多能干细胞与角膜边缘干细胞向非角化上皮分化上起重要作用。我们研究亦发现与正常外耳道皮肤相比，WNT7A在胆脂瘤中表达明显下调，而K14，K1，K10，Ki67表达显著升高， 提示中耳胆脂瘤上皮具有过度角化和增值的能力， 进一步的相关性分析显示，WNT7A的和K14，K1，K10，Ki67表达呈反比，此外，WNTA的表达与听力损失程度和胆脂瘤角化蛋白的厚度呈负相关。提示WNT7A的低表达可能导致了胆脂瘤中的表皮定向祖细胞向角化细胞分化，从而引起胆脂瘤上皮过度角化。进一步实验发现，WNT7A刺激Hacat细胞后，可显著降低K1的表达，而上调非角化上皮标志物K3的表达，进一步说明WNT7A可抑制胆脂瘤上皮定向分化祖细胞向角化细胞分化。另外，我们通过将角质形成细胞hacat与单核细胞THP-1共培养，模拟中耳胆脂瘤激活破骨细胞过程，成功诱导出破骨细胞细胞，而WNT7A刺激hacat与THP-1后，破骨细胞数量显著减少。进一步证实WNT7A可抑制角化引起破骨细胞的激活。前期证实细菌感染及TLR4介导的炎症反应促进中耳胆脂瘤增殖和骨质破坏。但是TLR4如何促胆脂瘤增殖、角化及破骨细胞激活，骨质破坏呢？我们进一步实验显示在人中耳胆脂瘤中，TLR4的表达与WNT7A的表达呈负相关，用LPS刺激hacat细胞可显著上调TLR4表达，下调WNT7A表达，而TLR4沉默后，WNT7A的表达得到回复，提示在中耳胆脂瘤中，TLR4可抑制WNT7A的分泌。