神经干细胞外泌体miRNA在宿主神经细胞的吞噬及其功能研究

Cell replacement is employed to restore the neural structure and function in neural stem/ precursor cell (NPCs) transplantation. However, this conduction could not account for the therapeutic effect of early neural function recovery after cell transplantation, apoptotic resistance, synapsgensis, and neural circuit remodeling, implying other mechanisms beyond cell replacement. We propose that NPC-derived exosomes, carrying various proteins and exRNA (mRNA and miRNA), play an important role in mediating the communication between NPCs and host cells. Also, NPC-derived exosomes functionally modulate the target cells causing the therapeutic effect. ..To test our hypothesis, we will employ live cell imaging and systematic super resolution imaging to characterize this novel cell-to-cell communication mechanism including, 1) To study the molecular mechanism of exosome uptake in receipt cell, 2)To monitor the important markers(candidate proteins and miRNAs) trafficking, 3) To validate the intracellular fate of exosome in receipt cell. Additionally, we will apply systematic combination of whole genome (microarrays) and whole proteome studies (SILAC) on target cells to identify the most regulated pathways in recipient cells. Finally, we will validate the connections between selected candidate pathways in target cells and the miRNAs with combination of lentiviral-based GoF & LoF experiments, qPCR and WB assay. ..Take together, this proposal will allow us to illustrate the connections between the miRNAs and downstream target affected in the recipient cells. Thus, offer insight understanding intracellular communication between NPC and receipt cells mediating by NPC-derived exosome.

既往的神经干细胞（NPCs）移植希望通过替代方式修复神经结构和功能，但细胞替代机制不能很好解释细胞移植早期抗神经元凋亡、神经环路重建和微环境等改善神经功能恢复，提示还可能存在其他修复机制。我们认为NPC在不同炎性环境可分泌不同外泌体（exosome, 包括蛋白质、mRNA和miRNA），并介导移植干细胞与宿主细胞间通讯，进而调控宿主细胞功能并起到临床治疗作用。为了研究这一新的细胞间通讯及检验我们的假说，我们将：1）经外泌体和吞噬相关蛋白示踪、超分辨成像技术研究宿主细胞（神经元、胶质细胞）对外泌体的吞噬、转运、分选机制；2）利用蛋白质组学、深度测序结合神经细胞功能研究等手段揭示外泌体miRNA对靶细胞的功能调控及作用机制。本研究将揭示NPC通过外泌体介导对神经细胞的调控作用及机制，为干细胞治疗或基于外泌体的治疗药物开发打下基础。

既往的神经干细胞（NPCs）移植希望通过替代方式修复神经结构和功能，但细胞替代机制不能很好解释细胞移植早期抗神经元凋亡、神经环路重建和微环境等改善神经功能恢复，提示还可能存在其他修复机制。我们认为NPC在不同炎性环境可分泌不同外泌体（exosome, 包括蛋白质、mRNA和miRNA），并介导移植干细胞与宿主细胞间通讯，进而调控宿主细胞功能并起到临床治疗作用。.为了研究这一新的细胞间通讯及检验我们的假说，我们通过经外泌体和吞噬相关蛋白示踪、超分辨成像技术研究了宿主细胞（神经元、胶质细胞）对外泌体的吞噬、转运、分选机制。1、发现大鼠、小鼠的宿主细胞（吞噬细胞）可以吞噬异源性外泌体。本研究证实：RCS大鼠视皮层胶质细胞、视网膜胶质细胞可吞噬hRPC（人来源）、mNPC（小鼠来源）分泌的异源性外泌体；小鼠NIH3T3细胞可吞噬hRPC（人来源）分泌的异源性外泌体。提示不同种属来源的外泌体可被其他种属宿主细胞吞噬，进而调控宿主细胞的功能。2、发现靶细胞通过通过网格蛋白介导的內吞通路吞噬外源性外泌体。 本项目通过观察NIH3T3、大/小鼠神经元、胶质细胞三类靶细胞吞噬神经干细胞分泌的外泌体，并进行了比较研究不同效应细胞对外源性外泌体的内吞速度；并通过主要吞噬通路的药理阻断实验研究了不同靶细胞对外泌体的内吞机制；进一步使用活细胞动态成像及超分辨显微镜成像技术（STED、SIM）证实小鼠神经干细胞分泌的外泌体主要通过网格蛋白介导的內吞通路内吞进入靶细胞，从而介导神经干细胞与大鼠神经系统细胞的通讯交流。3、利用蛋白质组学、深度测序结合神经细胞功能研究等手段揭示神经干细胞外外泌体间接神经保护作用及机制。hRPC经视网膜下腔注射后，原位分泌的外泌体、mNPC分泌的外泌体体外富集后注射至视网膜下腔，两种途径输入的外泌体大部分由视网膜小胶质细胞吞噬，可抑制视网膜小胶质细胞的活化从而下调小胶质细胞吞噬感光细胞功能，进而延缓视网膜退变动物模型的视功能下降，且两种处理对视网膜变性模式动物的视功能保护与小胶质细胞抑制同步。提示移植干细胞的神经保护作用主要来源于外泌体的作用。.本研究揭示NPC通过外泌体介导对神经细胞的调控作用及机制，为干细胞治疗或基于外泌体的治疗药物开发奠定了理论基础。