转录因子FrtR调控变异链球菌生物膜形成和耐氟能力的遗传机制研究

Dental caries is one of the major chronic diseases in China, which seriously jeopardizes the oral and systemic health. Streptococcus mutans expresses various stress tolerance mechanisms which allow the main cariogenic organism to colonize tooth surfaces as dental plaque and cause caries by demineralization of the enamel. Deciphering the ecological causes of dental caries is beneficial for overcoming the deficiencies of current prevention methods, eventually establish more effective strategy by eliminating the main cariogenic bacterium. This project will focus on the regulation mechanisms of transcription factor FrtR related biofilm formation and fluoride tolerance in S. mutans. In aim to study the biofilm and fluoride-resistant phenotypes as well as the cariogenicity of S. mutans, we initially created the FrtR and its target gene knockout and overexpression strains via genetic manipulation. Substantially, we will employ the protein-DNA interaction technologies such as EMSA, DNase I footprinting, and ChIP, combine with transcriptome and gene expression analysis to identify the regulated targets, regulatory network and mode of FrtR. Moreover, we will perform in virtual compound screening based on the crystal structure of FrtR protein, those chemical structure of compounds which can inhibit the physiochemical activity of FrtR will be further optimized. Ultimately, we will obtain the promising compounds target the S. mutans synergistic with fluoride. This project may provide a candidate strategy in preventing dental caries from the perspective of ecologic etiology, which is critical in theoretical as well as application research.

龋病作为我国重点防治的慢性病之一，严重危害口腔及全身健康。变异链球菌作为重要的致龋细菌，其在牙菌斑生物膜中的过度增殖引起微生态失衡是形成龋坏的重要原因。课题组前期发现转录因子FrtR与变异链球菌生物膜形成和耐氟能力关系密切，可以作为生态防龋的作用靶点，但有关FrtR的具体调控机制目前尚不清楚。针对这一科学问题，本项目拟以变异链球菌转录因子FrtR为研究对象。首先，通过遗传操作获得frtR的敲除及过表达菌株，鉴定其生物膜及耐氟表型和致龋毒力变化。然后，采用EMSA、DNase I footprinting和ChIP等蛋白质-DNA互作技术，结合基因表达检测系统解析FrtR的调控靶点、网络和模式。进一步基于FrtR蛋白质晶体结构筛选能够抑制其生理生化活性的候选化合物，最终通过结构优化获得能够与氟协同作用的变异链球菌靶向化合物，从生态病因角度提供新的防龋策略，具有重要的理论意义和应用价值。

龋病是我国重点防治的口腔常见多发病。变异链球菌作为最早被发现和最重要的致龋细菌，强大的生物膜形成能力和耐胁迫能力等是其致龋的关键毒力特征。课题组前期发现转录因子FrtR与变异链球菌的生物膜形成和耐氟能力密切相关，可以作为龋病生态防治的作用靶点，但FrtR的具体作用机制仍不清楚。针对这一科学问题，本项目分别从FrtR的生理功能、调控机制及抑制剂筛选三个方面开展研究。我们首先通过遗传操作成功构建了frtR及其靶基因如frtP的单敲除、双敲除、回补及过表达菌株。我们发现将变异链球菌frtR基因敲除后，在氟化物处理下其生物膜形成能力、胞外多糖合成能力及耐氟能力均显著下降。通过在frtR及frtP的双敲除菌株中回补表达frtP基因，我们确认frtR基因敲除后所导致的氟敏感表型是通过上调frtP表达产生的。进一步通过横断显微放射技术，我们发现敲除frtR基因降低了变异链球菌在牛牙表面诱导形成的脱矿深度和脱矿量。通过EMSA、DNase I足迹法等蛋白质-DNA相互作用技术、高通量测序技术和转录组分析技术等对FrtR的调控序列和靶基因进行系统鉴定，成功解析了FrtR调控变异链球菌生物膜形成和耐氟能力的作用靶点和调控模式。我们通过对前期建立的变异链球菌基因突变体库进行系统筛选，还发现了多个影响变异链球菌胞外多糖合成、生物膜形成和耐胁迫能力的新基因和新机制。最后，我们通过基于FrtR蛋白质晶体结构的计算机虚拟对接筛选，成功获得潜在的能够与FrtR结合和调节变异链球菌生物膜形成及耐氟能力的候选化合物，为靶向FrtR的防龋药物开发提供了先导化合物。通过细菌生长表型、体外生物膜表型、龋病动物模型，并结合细胞毒性实验的评估结果进行优化，项目组最终开发出多种能够有效抑制变异链球菌生物膜形成的天然产物化合物、植物提取物和纳米材料等新技术。本项目的研究成果为龋病的生态防治提供了大量新的理论和技术基础。