高特异高灵敏高通量单核苷酸突变信息获取新方法及应用研究

Nucleic acid mutation is one of the variation which takes place and is observed very frequently. Owing to many single nucleic acid mutations are closely associated with diseases and even are checked for diagnosis, detection of single nucleic acid mutations is of important significance in both research and clinic assay. It is very promising to detect the single nucleic acid mutations in very low copies with high specificity, high sensitivity and high accuracy, which should benefit people to get the clue of diseases at their very early stage. With the combination of genomic amplification, separation by mean of magnetic nanoparticles, micro-well assay and the single base extention feature of the ddNTP, this research is focused on the multiplex single base extention at the surface of Fe@Au magnetic nanoparticles by recycling the single base extention step. By means of this approach, the single point mutation information is amplified significantly and can be detected without hybridization and, therefore, the mutation with very few copies can be checked with high specificity, high sensitivity and high-throughput. Which can also contribute to the clinic diagnosis.

核酸突变是人类基因序列中最常见的变异，由于很多核酸点突变与疾病有着重要关联甚至是检验某些疾病的直接检验指标，基因点突变分析无论在理论研究还是临床实际检验分析中都有着重要意义，若能实现低丰度DNA点突变准确检测，尤其对重大疾病的早期诊断和预防至关重要。但至今国际上尚缺少能完全保障特异性并兼具高灵敏、低成本、高通量的核酸点突变检测方法。因此研究准确、快速、高灵敏、高通量且适用于临床的核酸点突变分析方法非常重要。本课题综合应用基因组扩增技术、纳米磁分离技术、微孔板分析技术以及ddNTP的仅单碱基延伸功能，通过荧光双脱氧核苷酸(ddNTP)在金包铁核壳纳米磁性颗粒表面对点突变位点多次循环单碱基延伸，不需杂交识别，而且显著放大点突变信息，从而实现低拷贝数DNA点突变信息的高特异性、高灵敏和高通量分析。也可为研究具有自主知识产权的临床大规模分子诊断高端系统提供方法学支撑。

本研究以ddNTP单碱基延伸技术为基础，结合磁分离，建立了磁在位高灵敏稳定的核酸点突变分析方法，并成功地将其应用于低丰度HBV血清/血浆样本的PreC区1896nt的突变检测。同时依托于本项目，研发了两款磁珠法快速核酸提取试剂盒，一台磁棒法全自动快速核酸提取仪和一台一体化卡盒式核酸检测系统。.采用溶剂热法，通过优化实验条件，制备了粒径分布分别为170 nm - 230 nm、270 nm - 350 nm、380 nm - 450 nm、420 nm - 550 nm、540 nm - 700 nm和1 μm - 2 μm的6种高分散性Fe3O4磁珠，同时对六种磁珠进行了表面SiO2包覆处理。所有磁珠都近似为球形，且分散性良好、磁响应时间短，磁珠表面成功地包覆了约20 nm - 30 nm厚的SiO2层，满足了后续研究中核酸提取、低丰度HBV高灵敏检测和磁在位核酸突变分析检测的需求。.在低丰度HBV血清/血浆样本DNA有效提取的基础上，结合磁分离技术、一步法巢式PCR和化学发光技术，建立了低丰度HBV高灵敏稳定检测方法。结果表明，外引物退火温度为57 °C，内引物退火温度为50 °C，内外引物比例为100: 1，外引物热循环数为18 cycles，磁珠表面探针浓度理论值为0.2 nmol/毫克，MB@Probe与待检靶序列的杂交温度为52 °C，杂交时间为20 min，最适合用于化学发光检测的功能化磁珠粒径为300 nm。与常规PCR相比，一步法巢式PCR能够更有效地从 < 500拷贝/mL的HBV血清样本中稳定地扩增获得待检靶序列，准确可靠。该方法可实现10个拷贝以下HBV的稳定检测。.优化了基于磁分离和单碱基延伸技术的高稳定SNP分型方法，并完成了HBV PreC区G1896A位点的基因分型。结果表明，粒径为300 nm的功能化磁珠在荧光信号获取过程中遮蔽效应最低；单碱基延伸热循环的退火温度为58 °C时，每毫克磁珠表面探针浓度的理论值为0.3 nmol时具有最高的SNP分型荧光强度和信噪比。同时，完成了177例HBV血清/血浆样本PreC区1896nt基因分型，其中74例为1896G基因型，103例为1896A基因型。每个HBV样本SNP分型均都获得了较强的荧光信号强度，野生型的信噪比均 > 12，突变型的信噪比均 < 0.085。分型结果与测序结果完全一致。