红笛鲷仔鱼抗菌免疫基因的克隆及表达时序研究

本项目以灭活溶藻弧菌诱导的红笛鲷仔鱼为研究对象，选择仔鱼母源抗体完全降解，而其自身免疫尚未完全建立这段"特异性免疫应答无能期"，通过抑制消减杂交技术（SSH），构建诱导组和对照组的cDNA差减文库，进而大量筛选与红笛鲷仔鱼抗菌免疫和免疫系统成熟相关基因的表达序列标签（ESTs），并对①非特异性抗菌因子基因如补体3（C3），toll-like 受体9（tlr9）等；②特异性免疫系统发育或成熟相关基因如重组激活基因1/2（rag-1/2）、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）、T细胞特异性酪氨酸激酶（lck）等；③参与免疫反应或免疫调节的细胞因子基因如巨噬细胞集落刺激因子受体（fms）等三类重要功能基因进行克隆，研究其基因的表达时序和诱导前后的表达水平，分析其表达差异，为阐明或部分阐明红笛鲷仔鱼阶段抗感染的免疫机制奠定基础。

本项目旨在以灭活溶藻弧菌诱导的红笛鲷仔鱼为研究对象，选择仔鱼母源抗体完全降解，而其自身免疫尚未完全建立这段“特异性免疫应答无能期”，通过抑制消减杂交技术（SSH），构建诱导组和对照组的cDNA差减文库，进而大量筛选与红笛鲷仔鱼抗菌免疫和免疫系统成熟相关基因的表达序列标签（ESTs），并对非特异性抗菌因子基因、特异性免疫系统发育或成熟相关基因、参与免疫反应或免疫调节的细胞因子基因等三类重要功能基因进行克隆，研究其基因的表达时序和诱导前后的表达水平，分析其表达差异，为阐明或部分阐明红笛鲷仔鱼阶段抗感染的免疫机制奠定基础。通过为期三年的研究，项目组分别构建了溶藻弧菌和哈氏弧菌诱导的红笛鲷头肾差减文库，筛选到大量免疫相关基因，并对其中的非特异性抗菌因子基因如红笛鲷的热休克蛋白家族基因（Hsp10、Hsp90、HSC70等）、主要组织相容性复合物Ⅰα抗原（MHCⅠα）基因、非特异性细胞毒性细胞受体（NCCRP-1）基因、α-珠蛋白和β-珠蛋白基因等进行了克隆和表达，研究了在细菌诱导下上述基因的变化规律；同时对红笛鲷特异性免疫应答的启动基因——两种重组激活基因（recombination activating genes，rag）进行了克隆、表达和表达谱分析。通过本项目的研究，基本阐明了在仔鱼时期，非特异性免疫应答在抗菌免疫中具有重要地位，为阐明或部分阐明红笛鲷仔鱼阶段抗感染的免疫机制奠定基础，将对苗种期疫苗的应用提供理论指导。尤其是对于重组激活基因的研究，证实了特异性抗体在仔鱼期间可以被诱导产生，具有重要应用前景。项目解决了研究内容所提到的科学问题，相关研究成果均发表在国内外著名期刊，包括SCI收录论文5篇，中文核心期刊6篇，并培养了博士研究生1名，硕士研究生4名，均超额完成了合同指标。