热激转录因子HSF调控种子耐脱水性获得的机理研究

The desiccation tolerance of seeds has great significance to the seeds storage and the preservation of germplasm resources. Because of the the accumulation and disappear of raffinose family oligosaccharides (RFOs) are consisitent with the acquisition of seeds desiccation tolerance,RFOs are consistend to be correlated with seeds desiccation tolerance and storage. But we still knows little about the the mechanism of expression regulation of GS gene, a key regulating enzyme gene in the RFOs' biosynthesis when the seeds obtained desiccation tolerance at present. In this study, we base on the sequence of the Brassica napus 's BnGOLS-1 promoter, intending to clone the HSF family which controls the expression of the GOLS-1 gene. By agrobacterium mediated transformation,we can get the transgenic plant of HSF that over-expression and RNAi, in order to analyse the changes of the desiccation tolerance in seeds of the transgenic plant. Otherwise, we can study the affection on the acquisition of the seed desiccation tolerance from the expression of HSF and expound the mechanism of the transduction of oxidative signaling during the acquisition of the seed desiccation tolerance, so it can reveal the patterns and ways of controlling between the HSF and the accumulation of RFOs as well as the acquisition of the seed desiccation tolerance. The result of our research will provide new technologies, methods and theoretical ground for the preservation of germplasm resources.

种子耐脱水性对于种子贮藏和种质资源的保存具有重要意义。由于棉子糖系列寡糖（RFOs）的累积及消失与种子耐脱水性的消长模式一致，所以推测它们与种子的耐脱水性和耐贮性有关。但是目前对RFOs生物合成途径中的关键调控酶GS基因在种子耐脱水性获得过程中的表达调控机制仍缺乏深入的研究。本实验以已得到的油菜BnGOLS-1基因启动子序列为基础，克隆获得可调控GS基因表达的热激转录因子HSF成员基因；通过农杆菌介导的转化方法获得相应HSF基因过表达及RNAi的转基因植株；分析转基因植株种子脱水耐性的变化；研究HSF的表达对种子脱水耐性获得的影响，阐明氧化信号在脱水耐性获得过程中的转导机理，揭示HSF对RFOs积累以及种子脱水耐性获得的调控途径与模式。研究结果将为种质资源保存提供新的技术方法和理论依据。

脱水耐性是种子抵御外界脱水胁迫的一种重要特性，对种子的贮藏和种质资源的保存具有重要意义，但目前对种子脱水耐性的机理研究尚不透彻。大量研究表明，棉子糖系列寡糖对种子脱水耐性具有重要的生理意义，前期实验克隆得到了油菜肌醇半乳糖苷合成酶基因BnGolS1的启动子序列，并通过GUS组织化学染色实验证明了其启动子活性。以此为切入点，分析发现BnGolS1启动子序列上的热激顺式元件（HSE）受到热激转录子BnHSFA4a的调控，且BnHSFA4a基因的表达伴随着种子脱水耐性的获得，并先于棉子糖系列寡糖的积累，因此推测BnHSFA4a参与了种子的脱水耐性获得的生理过程。克隆BnHSFA4a基因，同源比对后发现BnHSFA4a蛋白的一级结构与拟南芥AtHSFA4a具有高度相似性（84%）。构建BnHSFA4a-GFP融合表达载体，游离原生质体进行细胞定位实验后发现BnHSFA4a定位于细胞核，说明其具有典型的转录因子特征。构建pCAMBIA1301-BnHSFA4a过表达载体，利用花侵染的方法对野生型及athsfa4a突变体拟南芥进行遗传转化操作，获得异源表达BnHFSA4a基因及回复突变的拟南芥株系。生理指标检测结果表明过表达BnHSFA4a不但能够提高拟南芥种子对人工老化胁迫的耐性，还能提高种子发育、萌发过程及PEG诱导重建后的脱水耐性，并显著提高拟南芥种子中肌醇半乳糖苷合成酶基因（AtGolS1，AtGolS2）及棉子糖合成酶基因（AtRS2）的表达量以及下游相应寡糖合成酶的酶活以及寡糖含量。此外，过表达BnHSFA4a还能提高种子内相关抗氧化酶基因及若干抗逆相关基因的表达量，并显著提升种子内抗氧化酶含量。与之对应，athsfa4a基因突变体种子的耐水性、抗逆能力都明显弱于野生型种子；athsfa4a/BnHSFA4a回复突变株系具有与野生型株系相似的生理表型。本研究结果表明，热激转录因子BnHSFA4a可能通过直接或间接调控棉子糖系列寡糖代谢通路、抗氧化系统以及其他植物抗逆因子的表达来提高种子的脱水耐性。这一研究结果对种子脱水耐性机理的更深刻阐述提供了深层次的理论依据。