基于CRISPR/Cas9靶向修复ABCA4基因治疗遗传性视网膜变性的机理研究

Hereditary retinal degeneration (HRD) is a series of diseases which characterized by the progressive loss of photoreceptors and retinal pigment epithelium cells, with time leading to bilateral blindness. Until now no effective treatment for HRD, while gene therapy was considered as the potential treatment. Our previous studies discovered that the ATP-binding cassette (ABC) transporter gene (ABCA4) have collectively emerged as the most frequent cause of HDR. The gene therapy for HRD associated with ABCA4 gene has been hampered by the large size of the coding sequence (6.8 kb) which exceed the capacity of adeno-associated virus (AAV) vector for the delivery of the ABCA4 gene. CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) systems are a bacterial defense against invading foreign nucleic acids derived from bacteriophages or exogenous plasmids. CRISPR-mediated DNA editing was remarkably ease and efficiency, which was considered as a new tool for experimental gene annotation and therapeutic genome engineering. In this study, we plan to use intravitreal co-injection of CRISPR/Cas system and donor DNA to repair the mutated region in the ABCA4 knock out mouse model and to analyze the effectiveness. Our study will benefit to HDR, especially for HDR with mutations in genes with large coding size.

遗传性视网膜变性(HRD)是一类以感光细胞和视网膜色素上皮细胞进行性丧失并最终致盲的单基因遗传病，发病率高达1/3000。该疾病至今仍缺乏有效治疗，而基因治疗被认为是其潜在治疗方式。研究发现ABCA4是HRD主要致病基因之一，但传统的基因治疗困于载体转导能力差及基因编辑能力缺乏，无法对ABCA4长达6.8kb的cDNA进行转运。本研究拟利用CRISPR/Cas介导的基因编辑针对致病突变位点进行精确靶点修复，在ABCA4基因敲除小鼠模型中，通过玻璃体腔内注射腺病毒载体运输的CRISPR/Cas系统和外源性修复模板，对ABCA4基因进行原位修复。分析处理后其基因结构完整性、蛋白表达水平及视功能恢复情况；并通过检测RPE细胞内ATP酶活性、A2E的堆积及对全反式视黄醛的负荷能力以阐述ABCA4修复对逆转视网膜变性的作用机理，为大分子基因的原位精确修复在HRD基因治疗中的应用提供理论依据。

本研究主要是利用CRISPR/Cas介导的基因编辑针对致病突变位点进行精确靶点修复，在ABCA4基因敲除小鼠模型中，通过玻璃体腔内注射腺病毒载体运输的CRISPR/Cas系统和外源性修复模板，对ABCA4基因进行原位修复。分析处理后其基因结构完整性、蛋白表达水平及视功能恢复情况；并通过检测RPE细胞内ATP酶活性、A2E的堆积及对全反式视黄醛的负荷能力以阐述ABCA4修复对逆转视网膜变性的作用机理，为大分子基因的原位精确修复在HRD基因治疗中的应用提供理论依据。本研究的主要研究内容包括体外实验验证CRISPR/Cas质粒系统在细胞内对ABCA4基因的修复情况，并利用CRISPR/Cas腺病毒系统在小鼠视网膜修复ABCA4基因突变，并研究其细胞功能恢复情况，并探索CRISRP/Cas介导的ABCA4基因修复的机理。研究内容及进展依照课题申报书计划进行，并进一步尝试单碱基编辑技术，来修复ABCA4基因中占比最高的A/T突变，此种方法可以修复超过50%的点突变，可以快速修复大量点突变，从而大幅度的恢复ABCA4基因功能。我们的结果显示CRISPR/Cas腺病毒系统及ABE单碱基编辑器系统可在带有ABCA4基因突变的iPSCs中进行A/T点突变的单碱基修复，其中单碱基修复的效率为15%。本研究显示CRISPR/Cas腺病毒系统，尤其是ABE单碱基编辑器系统在遗传性视网膜变性细胞中的应用，为遗传性视网膜变性疾病的基因治疗提供了新的依据。并在体内实验中验证了CRISPR/Cas腺病毒AAV系统及ABE单碱基编辑器系统可用于遗传性视网膜变性疾病的基因治疗，目前在进一步研究F0代小鼠模型繁殖传代后ABCA4基因的修复作用能否稳定传递到F1代，为ABE单碱基编辑器系统在遗传性视网膜变性疾病的基因治疗的临床应用奠定基础。