Spy1介导p19INK4d磷酸化参与喉鳞癌原发性放射抗拒的机制

Inherent radioresistance is a main cause of laryngeal carcinoma radiotherapy failure, but the molecular mechanism is not clear. In our previous study, we found the correlation between Spy1 and inherent radioresistance of laryngeal carcinoma. It has been reported that p19INK4d phosphorylation closely related with DNA damage repair. We verified Spy1 interacted with p19INK4d and caused p19INK4d phosphorylation, so we presumed that Spy1 could regulates the phosphorylation of p19INK4d involved in the inherent radioresistance of laryngeal carcinoma. In this study, we will use 1) the technology of immunohistochemistry detect the expression of Spy1 and p19INK4d in radioresistant and radiosensitive tissues of human laryngeal carcinoma, and analyze their correlation with radioresistance; 2) we will built stable cell line of Spy1 overexpression and interference, then detect the change of Spy1 expression impacts on the regulation of p19INK4d phosphorylation and DNA damage repair, in addition, we will built the expression vector of Spy1 different domain, verify the interaction site of Spy1 and p19INK4d ; 3) we further confirm that Spy1 regulates p19INK4d in the inherent radioresistance of human laryngeal carcinoma by xenografts in nude mice. The results of this study not only help us to enrich understanding of the molecular mechanisms of laryngeal carcinoma radioresistance, but also provide a new target to solve the radioresistance of laryngeal carcinoma for clinic.

原发性放射抗拒是喉鳞癌放疗失败的主要原因之一，其分子机制尚不清楚。本课题组在预实验中发现Spy1与喉鳞癌原发性放射抗拒相关，但机理不明。研究发现p19INK4d的磷酸化与DNA损伤修复密切相关，我们证实Spy1与p19INK4d相互作用并导致其磷酸化，因此推测Spy1通过介导p19INK4d的磷酸化参与喉鳞癌原发性放射抗拒。本课题拟应用1)免疫组化技术检测放射抗拒和敏感的人喉鳞癌标本中Spy1、p19INK4d的表达并分析其与放射抗拒的相关性；2）构建稳定过表达和干扰Spy1的喉鳞癌细胞株，检测改变Spy1的表达对p19INK4d的磷酸化状态的调控及DNA损伤修复的作用，并构建Spy1不同结构域的表达载体，明确Spy1与p19INK4d的作用位点；3）构建裸鼠成瘤动物模型，在体内进一步验证。本项目的成功研究将有助于丰富认识喉鳞癌放射抗拒的分子机制，并为临床探索喉鳞癌放射抗拒提供新的靶点。

肿瘤细胞原发性放射抗拒是导致喉鳞癌放疗失败的主要原因之一。本项目在前期研究中发现Spy1可能介导了喉鳞癌的原发性放射抗拒，但其具体的作用方式及机制尚未明确，因此，我们从组织、细胞和动物三个层面来进一步进行探讨。首先利用免疫组化技术检测人喉鳞癌标本中Spy1、p19INK4d的表达并分析其与喉鳞癌病人预后的相关性；其次构建稳定过表达和干扰Spy1的喉鳞癌细胞株，检测改变Spy1的表达对p19INK4d的磷酸化状态的调控及DNA损伤修复的作用，并构建Spy1不同结构域的表达载体，明确Spy1与p19INK4d的作用位点；最后构建裸鼠成瘤动物模型进行体内验证。结果发现：① Spy1在喉鳞癌组织中过表达，且与病人吸烟及淋巴转移相关，Spy1高表达病人的五年生存率也显著低于对照组；p19INK4d则在对应的癌旁组织中高表达，它的表达与病人的临床特征及预后均无相关性。②在放射抗拒细胞中干扰Spy1,抑制了细胞增殖、促进了细胞凋亡，并使细胞周期在G2/M期阻滞，从而增强了细胞的放射敏感性；而在放射敏感细胞中过表达Spy1，则促进了细胞增殖、抑制了细胞凋亡，并降低了细胞周期G2/M期的阻滞，增加了细胞的放射抵抗性。③Spy1与p19INK4d存在相互作用，促进p19INK4d的磷酸化，调节了放射导致的DNA损伤修复相关蛋白的表达，且呈p19INK4d依赖性。④通过裸鼠实验初步发现，X线照射后，Spy1干扰组与对照组相比，裸鼠肿瘤体积更小、重量更轻，增强了肿瘤的放射敏感性。通过以上的研究工作，我们初步阐明了Spy1介导喉鳞癌原发性放射抗拒的作用及其分子机制，为探索喉鳞癌放射增敏治疗提供了新的靶点，具有较好的学术及应用价值。