基于关联分析克隆美洲黑杨抗锈病基因

As a model trees, Populus spp. plays an important role in forest research and product. Among the biotic stressors with an economic impact on poplar production, the most harmful and widespread are biotrophic rust fungi of the basidiomycete genus Melampsora. In recent years, the rust has break out on the Populus deltoides and resulted to significant reductions in wood production. A F1 segregating population was derived from a resistant clone of T120 and a susceptible clone of I-63 that contained the rust resistance gene which has been well mapped in this population. On this basis, single nucleotide polymorphism (SNP) will be detected on the resistance gene in the resistant clone and the susceptible. The germplasm resources of Populus deltoides would be separated into different genotypes by the SNP markers. The rust disease resistance of all clones in the germplasm resources would be detected after inoculating. Association analyses between rust disease resistance and single nucleotide polymorphism were conducted by linkage disequilibrium mapping (LD mapping) for all clones of Populus deltoides to detect and clone rust disease resistance gene. The rust resistance gene will be further confirmed. This project will provide resistance gene for breeding disease-resistant clone quickly by genetic engineering and establish high efficient and workflow to clone resistance gene in forest species.

杨树作为林木基因组研究的模式树种在林业生产中也占据着极其重要的位置。杨树锈病是影响杨树栽培与生产的最严重病害之一，近年来杨树锈病在推广的美洲黑杨品种中呈爆发趋势，严重影响了美洲黑杨的生长。项目组前期采用抗锈病的美洲黑杨无性系T120和感锈病的美洲黑杨无性系I-63杨杂交构建了F1分离群体，利用AFLP和SSR标记构建了高密度遗传图谱，并精细定位了美洲黑杨抗锈病基因。在此基础上本项目通过检测抗病和感病两亲本抗病基因区的SNP，对美洲黑杨种质资源库材料进行基因型分析，并对种质资源库材料进行抗病性测定，结合基因型数据与抗病性状的表型数据进行关联分析，识别和克隆美洲黑杨抗锈病基因，并对克隆的基因进行功能验证，为利用基因工程手段快速培育杨树抗病新品种提供抗病基因。同时通过该项研究，建立在远交木本植物中快速、高效克隆未知基因的策略和相关实验平台。

杨树作为林木基因组研究的模式树种在林业生产中也占据着极其重要的位置。杨树锈病是影响杨树栽培与生产的最严重病害之一，近年来杨树锈病在推广美洲黑杨品种中呈爆发趋势，严重影响了杨树的生长。本研究中对长江中下游地区采集的锈菌通过电子显微镜和扫描电镜进行观察，表明长江中下游地区的锈菌在形态上和Melampsora larici-populina相似。在分子水平上证实长江中下游地区的锈菌都属于Melampsora larici-populina。.前期的研究结果表明杨树对锈病的抗性是由一个主效基因MXC3控制，且将其定位在杨树的第4染色体上，但发现含该基因的一段300Kb的染色体片段受到严重的重组抑制，使利用染色体步移技术克隆该基因变得几乎不可能。本研究结合前期研究工作，对MXC3所在区域的分子标记进行分析，利用JGI网站对杨树全基因注释结果，对MXC3所在区域进行生物信息学分析，结果在该区域发现只注释了一个抗病相关基因，因此，本研究先将该基因序列导出，根据序列信息进行引物设计，利用生物信息学技术和RACE技术克隆出了位于杨树第4染色体上抗叶锈菌杨树基因MXC3。.选取92个基因型杨树无性系为研究对象，利用MXC3基因全长引物通过PCR方法扩增出相应基因型中MXC3基因序列，再用454高通量测序仪进行测序，对抗病锈病基因MXC3的SNP和InDel进行分析，结合92个基因型杨树无性系对锈病的抗性，基于关联分析进一步证实MXC3基因是抗锈病的主效基因。MXC3基因cDNA全长2275bp，包括编码653个氨基酸的开放阅读框序列。MXC3是在质膜内表达的疏水蛋白。该基因含有两个主要的保守域，分别属于奇异果甜蛋白家族和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，这两个保守域都具有抗病特性。.本研究利用Gateway技术成功构建了MXC3 基因的RNAi植物表达载体，转化农杆菌感受态细胞，进行基因功能验证。