棉花跨膜受体类基因介导的抗黄萎病机制研究

Verticillium wilt is the most destructive fungal disease in cotton production. Selection and identification of resistance genes has become a popular research field in genetic engineering modification for cotton resistance to Verticillium wilt. Previous study indicated that the family of receptor-like genes was associated with host resistance to Verticillium wilt. However, the function of these resistance genes in cotton is still unknown. In this project, a receptor-like gene GbaRLP3 involved in the resistance to Verticillium wilt disease was identified by gene prediction, association analysis, transcriptome analysis and gene overexpression, etc. The characterization of GbaRLP3 for resistance to Verticillium wilt will be demonstrated by gene expression, polymorphism analysis and subcellular localization. The function of GbaRLP3 in resistance to Verticillium dalihae infection will be illustrated by virus induced gene silencing (VIGS) and transgetic overexpression cottons. The crucial domains of the candidate gene involved in recognition by avirulent gene will be delimitated by domain swapping. Furthermore, critical signal regulatory factors in cotton plants will be identified by transcriptome analysis of resistant transgenic cotton lines and VIGS. The results will expand our knowledge in recognition and signal transduction involved in cotton resistance mediated by GbaRLP3, and will also provide theoretical foundations for genetic engineer modification of cotton resistance to Verticillium wilt.

黄萎病是我国棉花生产上最具毁灭性的真菌病害，筛选和鉴定抗病基因已成为棉花抗黄萎病基因工程改良和黄萎病防治的热点课题。已有研究表明，跨膜受体类基因参与了寄主植物对黄萎病的抗性反应，但参与棉花抗黄萎病的跨膜受体类基因及其介导的抗病机理报道很少。本项目前期结合跨膜受体类基因的预测、群体关联分析、转录组分析、基因过表达等研究筛选到参与黄萎病抗性反应的跨膜受体类靶标基因GbaRLP3。在此基础上，开展基因表达、多态性分析和亚细胞定位，研究靶标基因的抗黄萎病特性；通过基因沉默、转基因棉花鉴定其抗黄萎病功能；利用烟草瞬时表达解析基因结构域与病原菌无毒基因识别的关系，明确基因的抗病功能结构域；通过抗性转基因棉花株系的转录组测序和基因沉默筛选和鉴定关键的信号调控因子。上述研究将初步解析棉花跨膜受体类基因介导的抗病信号识别和传导途径，为棉花抗黄萎病基因工程改良提供理论依据。

黄萎病是我国棉花生产上最具毁灭性的真菌病害，筛选和鉴定棉花抗黄萎病基因已成为抗病基因工程改良和黄萎病防治的热点。已有研究表明，跨膜受体类基因参与了寄主植物对黄萎病的抗性，但参与棉花抗黄萎病的跨膜受体类基因及其介导的抗病机理报道很少。本项目前期结合跨膜受体类基因的预测、定位、群体关联分析、转录组、基因过表达等分析筛选到1个参与黄萎病抗性的跨膜受体类靶标基因GbaRLP3。在此基础上，本项目开展了：1）GbaRLP3基因基本特性研究，发现棉花GbaRLP3基因强烈响应了大丽轮枝菌侵染；GbaRLP3基因在各棉种中共发现了数百个变异位点单核苷酸变异和插入缺失突变，造成115个非同义突变，非同义变异位点和同义变异位点的比率为1.78，表明GbaRLP3基因在进化过程中经历了正选择作用；利用瞬时表达技术分析发现融合蛋白主要定位与细胞质膜上，表明GbaRLP3主要在质膜上发挥功能。2）明确了GbaRLP3基因的抗黄萎病功能。GbaRLP3基因沉默后棉花的发病程度显著升高，叶片出现典型的黄化和萎蔫症状，菌体繁殖量显著增加，提高7倍以上。转基因拟南芥实验表明，相对于野生型，过表达株系叶片黄化、萎蔫症状明显减弱，生长延缓现象也有所好转；创制了转基因棉花材料，初步鉴定表明转基因株系可以显著提高棉花对黄萎病的抗性。3）GbaRLP3基因结构域与抗病功能解析。GbaRLP3基因结构域拆解分析表明GbaRLP3识别Ave1介导的细胞坏死需要依赖基因的完整性；将基因4个主要区域（胞内区、胞外区、胞外LRR变异区和胞内LRR保守区）与Ve1互换，结果表明替换后的基因无法类似于Ve1识别Ave1引起细胞坏死，这一结果表明棉花中的GraRLP3识别Ave1可能有别于番茄的Ve1基因。4）GbaRLP3基因介导的抗病信号传导。比较分析了野生型材料和转基因株系基因差异表达谱，发现与内吞作用及抗病信号途径（乙烯和茉莉酸信号）相关的基因被显著诱导诱导表达，进而激活了nodulin家族蛋白、富含甘氨酸和脯氨酸蛋白等抗病防卫反应相关蛋白表达，最终促进了细胞壁增厚和植物抗毒素合成以增强了寄主对大丽轮枝菌的抗性。上述研究初步明确了GbaRLP3基因具有抗黄萎病功能并初步阐明了其介导抗病防卫反应的分子机制；同时为后续继续开展GbaRLP3基因功能研究奠定了良好的基础，也为后续抗黄萎病基因工程改良提供了靶标基因和材料。