T6SS-4在类鼻疽伯克霍尔德菌致病性和生物学功能中的作用

Burkholderia pseudomallei is the causative agent of melioidosis.The organism can infect any organ system, although the lung is the most common organ affected.Melioidosis is often fatal, as illustrated by the high mortality and misdiagnosis rates among cases.Hainan island is regarded as a main endemic area in China. As a facultative intracellular pathogen,virtually nothing is known about the molecular mechanisms that allow B. pseudomallei to survive intracellularly.Type VI secretion system, a new bacterial secretion system，mediates bacterial virulence on host cells and drug resistance.And there is significant virulence differentiation between the environmental and clinical strains. Interestingly, B. pseudomallei contains six T6SSs,it is more than other bacterial pathogens.PCR identification of TssM-4 (structure gene of T6SS-4) in clinical isolates of Bp and environmental isolates stored in our lab, which has 100% possession in clinical isolates and 15.1% in environmental isolates.Unlike clinical isolates, the environmental isolates were only weakly virulent to RAW 264.7 macrophages 24 h after infection.Our observations suggest that,the T6SS-4 may be involved in the pathogenicity of B. pseudomallei.To investigate the function of T6SS-4, T6SS-4 deletion mutants will be made . Functional analysis targets about bacteria infection, including cell adherence, cytotoxicity, autophagy, apoptosis and hemolysis.These virulence proteins will be selected as candidate vaccine antigens and tested in the BALB/c mouse model of infection.We want to prove the pathogenicity mechanism and function of T6SS-4, and find a new strategy for melioidosis prevention and cure.

类鼻疽伯克霍尔德菌（Bp）所致的类鼻疽误诊率和病死率极高，肺部感染最为常见，海南是我国发病率最高的地区。作为兼性胞内菌，Bp在胞内存活和繁殖机制仍不清楚。VI型分泌系统（T6SS）为新发现的细菌分泌系统，与细菌的致病力等有关，有趣的是Bp有6套T6SS，远超过其它致病菌,可能与其超强致病力和对多种药物天然耐药有关。我们前期工作发现，T6SS-4结构蛋白基因TssM-4在Bp临床和环境分离株中的携带率分别为100%和15.1%，不携带TssM-4的环境株对巨噬细胞的侵袭力弱于临床株，提示T6SS-4可能与Bp的致病力密切相关。本研究拟构建缺失T6SS-4核心基因的Bp缺失株，观察其对细菌表型和耐药性影响；展开细菌对细胞和宿主的致病机制研究；筛选毒力蛋白作为疫苗免疫小鼠，观察其保护作用。如获预期结果，有望揭示T6SS-4的生物学功能、耐药机制和致病机制，为类鼻疽的防治提供新思路和理论依据。

类鼻疽是一种常见的由伯克霍尔德氏菌（Bp）引起的致死性传染病。它被称为“非凡的模仿者”作为临床表现与肺结核等化脓性细菌感染相似,类鼻疽没有特异性临床表现，疾病以急性或亚急性和慢性复发性形式，死亡率极高。感染的危险因素包括糖尿病、酒精中毒、肾功能不全和慢性类固醇使用。该菌具有特定的生态条件，生长在赤道南北纬20度之间的土壤和死水中；主要流行地区包括东南亚、澳大利亚北部和南美洲地区。大多数患者主要通过接触受污染的土壤或水、经皮接种或吸入感染。海南岛北纬19度和20度之间，在地理维度上靠近泰国，是一个流行病区，面积35400平方公里，海岸线长达1823公里，人口约900万。这个省被称为“中国菜篮子”，拥有70万公顷的蔬菜种植基地和稻田。在海南，超过100万人有感染Bp的风险，这是一个重大的公共卫生问题，也是社区获得性败血症的一个重要原因。许多革兰氏阴性菌中发现存在VI型分泌系统T6SS，对致病菌的毒力有贡献。伯克霍尔德菌具有大量的毒力因子，其中TssJ是T6SS的外膜脂蛋白，与TssM的c端区相互作用，我们通过构建突变体和互补菌株来确定TssJ-3的功能。本研究可以为伯克霍尔德菌的发病机制提供一个新的视角，为发现潜在的T6SS效应物奠定基础。结果表明，TssJ-3的缺失会影响菌株的生长速率。我们分别在37℃和42℃培养，缺失菌株进入对数阶段的时间比野生型晚4个小时，同时进入对数期也晚了近6小时，这说明TssJ-3可能影响了细菌的生长。TssJ-3的丢失显著降低了细菌生物膜的形成量，可能是TSSJ、Tssl和Tssm形成的膜融合结构被破坏，影响HCP的分泌功能，从而影响生物膜的形成量。随后，我们测量了HCP的表达，发现其表达水平明显下调，这也证实了我们的预测。但具体机制尚不明确，这也是后续工作的研究方向。利用A549细胞检测野生和缺失株诱导的宿主细胞因子的转录水平，发现TssJ-3可以显著抑制IL- 1和IL-6的表达水平，表明T6ss可以抑制炎症反应和宿主的免疫反应,从而促进免疫逃避和生存的细菌在宿主体内,从而导致发病。