心房颤动相关miRNA的鉴定及其功能研究

用miRNA芯片、qRT-PCR和Northern blot分析大鼠房颤细胞模型中细胞miRNA表达水平；构建相关抗miRNA的反义寡核苷酸或合成pre-miRNA，下调或上调大鼠心房肌细胞中相关miRNA，快速起搏后观察细胞动作电位、离子通道电流和相关通道基因、缝隙连接蛋白mRNA和蛋白表达水平的变化；用TargetScan和PITA靶点预测程序分析miRNA作用靶点；构建靶基因3′UTR荧光素酶报告基因质粒载体，双荧光素酶法检测确定miRNA作用靶点；改变大鼠心房肌细胞相关miRNA簇表达水平，在加用胺碘酮的基础上快速起搏后观察细胞动作电位、离子通道电流和相关通道基因、缝隙连接蛋白mRNA和蛋白表达水平的变化。本项目通过研究miRNA与房颤发生、心房电重构的关系，将进一步阐明miRNA在房颤发生中的作用机制，为房颤药物治疗提供新的靶点和思路。

摘要：背景：房颤是临床最常见的持续性心律失常，可引起心衰加重和周围动脉血栓形成，增加脑中风的发生率和患者的死亡率。目前，有关房颤的发病机制仍然有待阐明。KCNA5、KCNJ2是心房肌细胞重要的钾离子通道编码基因；同时研究认为，MiRNA可通过调控离子通道蛋白表达而表现出促房颤或抗房颤、促凋亡或抗凋亡的作用。. 结果：1、MicroRNA芯片分析房颤与窦性心律患者心房组织差异表达的miRNA，结果显示，与窦性心律患者比较，房颤患者心房组织中差异表达的miRNA共有26个。2、生物信息学方法预测发现，房颤相关基因KCNA5、KCNJ2与miR-19b可能存在靶向关系；qRT-PCR法检测表明，与窦性心律患者比较，房颤患者中miR-19b表达减少。3、Western blot法检测显示，与窦性心律患者相比，房颤患者中KCNA5、KCNJ2的蛋白表达明显增加。4、qRT-PCR法检测显示，与对照组比较，miR-19b过表达组miR-19b表达水平明显增加，miR-19b干扰组miR-19b表达水平明显减少，miR-19b阴性对照组miR-19b表达水平未发生明显变化。5、Western blot法检测显示，与对照组比较，miR-19b过表达组KCNA5、KCNJ2蛋白表达水平明显减少；miR-19b干扰组KCNA5、KCNJ2蛋白表达水平明显增加；阴性对照组KCNA5、KCNJ2蛋白表达水平未发生明显变化；qRT-PCR法检测显示，miR-19b过表达组、miR-19b干扰组及阴性对照组H9c2细胞KCNA5、KCNJ2 mRNA的表达水平均无显著性变化。6、建立H2O2诱导的H9c2细胞损伤模型，CCK-8法检测显示，miR-19b抑制H9c2细胞活力；流式细胞术检测显示，miR-19b促进H9c2细胞凋亡。7、miR19b下调引起KCNA5基因编码的钾离子电流Ikur增强。. 结论： 1、房颤相关miR-19b 抑制H9c2细胞KCNA5、KCNJ2蛋白的表达。2、miR-19b抑制H9c2细胞活力、促进细胞凋亡。3、miR19b下调引起KCNA5基因编码的钾离子电流Ikur增强。