白粉菌诱导下中国野生葡萄VpR82H基因特异定位表达研究

中国野生葡萄是很好的抗病基因资源库。国外鲜有对中国野生葡萄的研究报道。国内近年虽然克隆了部分中国野生葡萄抗白粉病相关基因，但其抗病功能有待进一步鉴定。因此，继续挖掘利用中国野生葡萄抗病基因，具有重大理论价值和广阔应用前景。本项目拟建立基于生物信息比较的葡萄同源基因克隆新方法，以极抗病中国野生葡萄白河-35-1为材料，克隆广谱抗病基因RPW8.2同源基因VpR82H（RPW8.2基因编码的蛋白2009年底被证明是在所有病原菌和寄主互作过程中发现的、第一个特异锚定到寄主与病原菌互作界面的蛋白），通过建立白粉菌诱导下中国野生葡萄VpR82H基因特异定位表达系统，揭示白粉菌诱导下中国野生葡萄VpR82H基因在拟南芥和欧洲感病葡萄中的特异定位表达规律，并利用这些规律，最终从分子生物学、细胞生物学和分子植物病理学等方面阐明中国野生葡萄VpR82H基因抗病机理，为相关研究提供理论依据和技术支撑。

中国野生葡萄是很好的抗病基因资源库。国外鲜有对中国野生葡萄的研究报道。因此，挖掘利用中国野生葡萄抗病基因，具有重大理论价值和广阔应用前景。本项目以极抗病中国野生华东葡萄白河-35-1为材料，利用基于生物信息比较的葡萄同源基因克隆法，克隆了广谱抗病基因RPW8.2在华东葡萄白河-35-1中的同源基因VpR82共2个，克隆了RPW8.2在欧洲感病葡萄‘五月紫’和‘黑比诺’中的同源基因VvR82H各1个，并登录GenBank；白粉菌诱导下，中国野葡萄VpR82H基因可以在转基因拟南芥植株中特异定位表达，但与RPW8.2基因特异定位表达在白粉菌吸器周围不同，VpR82H基因更多地集中在菌丝周围表达；分离了一个高致病性的葡萄白粉菌菌株，暂命名为NAFU1，以便后续很好开展抗病性及葡萄与白粉菌互作研究；利用基因枪法，在 ‘里扎马特’葡萄组培苗幼嫩、健康叶片中瞬时表达VpR82H基因，接种葡萄白粉菌NAFU1后，也可以观察到VpR82H基因在菌丝周围表达；诱导并保存了葡萄无核品种‘无核白’和酿酒品种‘霞多丽’花药胚性愈伤组织，并利用葡萄胚性愈伤组织，采用根癌农杆菌介导法，获得了经Southern Blot和RT-PCR证实的RPW8.2转基因植株18株，VpR8H转基因植株28株；RPW8.2和VpR8H转基因植株部分叶片有不同程度的肉眼可见坏死斑，台盼蓝染色表明坏死斑是细胞坏死所导致，RT-PCR结果证实这些表型是由于所转基因表达引起的；用白粉菌NAFU1分别接种RPW8.2 和VpR82转基因葡萄叶片，RPW8.2-YFP和VpR82-YFP均能在转基因葡萄中特异表达，与拟南芥等转基因植物中的结果相似，但RPW8.2可以特异定位到白粉菌吸器周围，而VpR82是定位在菌丝周围；进一步观察转基因葡萄叶片白粉菌菌丝生长，转基因株系菌丝生长量小且有细胞坏死，而非转基因葡萄叶片上菌丝生长量大且无细胞坏死。这些结果初步说明，在白粉菌诱导下，VpR8H和RPW8.2是通过特异定位表达，抑制葡萄白粉菌菌丝生长，从而增强转基因葡萄的抗病性； 此外，VpR82H对非生物胁迫（如ABA、SA、低温和高温）也有一定反应。这些结果为最终利用VpR82H开展葡萄抗病遗传改良研究提供理论依据和技术支撑。邀请美国专家1人来校合作交流，参加学术会议9次；发表论文4篇；协助培养毕业硕士1人。