BTB锌指蛋白基因在原发性肝癌中表达的表观遗传学调控机制研究及意义探讨

抑癌基因异常甲基化是近年来肿瘤早期诊断的研究热点。我们最近发现一种新的抑癌基因-BTB锌指蛋白基因ZB1，前期工作预示其在原发性肝癌中的表达可能受表观遗传学-DNA甲基化机制调控，但国内外尚无这方面的系统研究。本课题以ZB1为研究目标，通过其启动子区甲基化水平与该基因表达的关系来揭示肝癌中ZB1表达的表观遗传学调控机制，同时通过载体的构建和转染、克隆的筛选和计数、流式细胞仪及调亡相关蛋白的检测等方法来确定该基因对人肝癌细胞生长及调亡的作用，并进一步在亚细胞定位、相关基因及信号通路的影响等方面深入探讨它在肝癌发生中的作用机理；最后分析肝癌临床标本的ZB1甲基化水平与患者临床资料的关系，探讨其作为肝癌早期诊断和预后的分子标志物的可行性。本课题在国际上首次鉴定ZB1是否为肝癌发生中的抑癌基因，为肝癌特异性甲基化谱的完善提供新的靶点和途径，对原发性肝癌发病机制的进一步阐明和早期诊断具有重要意义。

抑癌基因甲基化有望作为一种特异性的分子标志物在肿瘤的早期诊断、预后评估中发挥重要作用。MAPK10从属于促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）大家族中的JUN氨基末端激酶 JNK)亚群，最近的研究提示其可能为一候选抑癌基因。在本文中，我们以MAPK10为研究目标，通过其启动子区甲基化水平与该基因在HCC细胞表达的关系来揭示MAPK10在HCC中表达的表观遗传学调控机制，同时通过载体的构建和转染、亚细胞定位、克隆的筛选和计数、流式细胞仪及TUNEL法对细胞凋亡的检测、凋亡相关基因表达的观察、联合常规化疗药物对HCC细胞毒作用的分析等方法来明确该基因对人HCC细胞的作用，并进一步在临床标本中探讨MAPK10表达沉默的临床意义。结果表明：MAPK10基因在几乎所有的正常组织包括肝组织中表达，但在HCC细胞株中却有67%被沉默或表达显著降低，且与相应的启动子区甲基化状态具有良好的相关性。从HCC的石蜡标本中也观察到，MAPK10在HCC组织中往往表达阴性或弱阳性，较癌旁组织显著降低。我们进一步检测了临床收集的HCC标本的MAPK10基因启动子甲基化水平，发现大部分存在启动子甲基化，且这些标本中的MAPK10表达正好缺失。为了进一步证实MAPK10基因沉默与启动子甲基化之间的关系，我们还利用去甲基化药物作用于MAPK10沉默的HCC细胞株，结果提示：伴随MAPK10基因甲基化状态的改变，其在HCC细胞中的表达也得以恢复。细胞功能试验则表明，通过载体构建、基因转染后，MAPK10可显著抑制HCC细胞的克隆形成、诱导凋亡发生、并能增强HCC细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性。更有意义的是，我们观察到MAPK10转入HCC细胞后，凋亡相关基因p53及Caspase 家族的mRNA表达及蛋白表达均较前明显增强。最后，我们还发现MAPK10表达缺失与HCC进展分期、肝内转移灶发生、高水平甲胎蛋白（AFP）显著相关；MAPK10沉默的HCC患者较MAPK10表达的患者预后更差，生存时间明显缩短。我们的研究表明，MAPK10是HCC发生发展中的一个重要抑癌基因，表观遗传学-DNA甲基化机制是其表达的调控机制之一；MAPK10在HCC中的表达与HCC患者的临床分期及预后密切相关，其表达丢失往往提示HCC病人预后更差。我们已经完成了一篇高质量的博士研究生学位论文，相关的系列论文正在投稿中。