基于抗分析物\抗吖啶酯双特异性抗体的化学发光标记免疫分析方法研究

Immunoassay is an important method in food safety detection. Nowadays, its sensitivity is confronted with more demanding requirments. Chemiluminescent immunoassay (CLIA) is a sensitive immunoassay by conjugating a antibody or a antigen with acridinium esters. But the average quantity of acridinium esters conjugated to the antibody can not be more than 2.8. Otherwise, the antibody is apt to be denatured. Furthermore, the conjugating reaction is complicated and lacking repeatability. Based on the acquired monoclonal antibodies against two model analytes Sudan Red and BSA, this project is to develop a high affinity monoclonal antibodies against the acridinium ester, and further develop two bispecific monoclonal antibody against the model analyte (Sudan RedⅠor BSA) and the acridinium ester by hybridoma techniques. Meanwhile, a polymerized acridinium ester (n>10) will be synthesized to improve the chemiluminescent efficiency. Then, two model CLIA methods (competitive CLIA and sandwich CLIA) will be established on the two bispecific antibodies and the polymerized acridinium esters (such research has not been reported by now). The new methods aimed at improving the sensitivity of CLIA. In this project, systematic analysis work will be done on sensitivity, accuracy, and precision of the two CLIA methods. Those methods will also be compared with traditional CLIA methods. The target of this project is to exploring sensitive, stable, and efficient CLIA methods meeting the demands of modern food safety detection.

免疫分析在食品安全检测中发挥着重要作用，其灵敏度面临着越来越高的要求。化学发光标记免疫分析（chemiluminescent immunoassay，CLIA）是用化学发光剂（吖啶酯）偶联标记抗原或抗体的免疫分析方法，具有较高的灵敏度。但在CLIA中，抗体上偶联标记的吖啶酯数量不能太高（n<2.8），否则易造成抗体失活；且标记反应操作繁琐、重复性不好。本研究拟在已获苏丹红Ⅰ和BSA二种分析物单抗的基础上，制备抗吖啶酯的高亲和力单抗，再通过四瘤杂交法，研制二种抗分析物/抗吖啶酯的双特异性抗体，研究建立无需偶联标记抗体的竞争CLIA方法和夹心CLIA方法；同时，通过合成多聚吖啶酯（n>10）增加发光强度，以提高CLIA方法的灵敏度(该研究未见报道)。本课题将对这二种方法的检测限、精密度、准确度和稳定性进行系统分析，并与传统CLIA方法进行比较研究，探索灵敏度高、稳定性强的免疫分析新方法。

免疫分析方法在食品安全检测领域中发挥着重要作用，随着国内外对食品安全问题的日益重视，各种食品安全的限量标准越来越严苛，对免疫分析方法的灵敏度也提出了更高的挑战。免疫发光分析方法是近年来的研究热点，免疫发光分析方法包括免疫化学发光分析方法（CLIA）和酶联免疫化学发光分析方法（CLEIA）。本研究旨在通过制备抗分析物/抗吖啶酯的双特异性抗体，以之建立多种模式的免疫发光分析方法，以探索提高免疫发光分析方法灵敏度的新途径。本研究在成功制备了抗苏丹红Ⅰ、双酚A、吖啶酯和vB12等分析物单克隆抗体的基础上，建立了酶联免疫吸附检测方法、免疫化学发光分析方法和酶联免疫化学发光分析方法等多种免疫分析方法，在食品安全检测领域具有较高的科学价值和应用前景。同时，在上述单克隆抗体的基础上，通过化学偶联法、三瘤细胞杂交法和四瘤细胞杂交法，成功研制了抗苏丹红Ⅰ/抗吖啶酯和抗vB12/抗吖啶酯双特异性抗体，建立了基于多聚吖啶酯-双特异性抗体的免疫化学发光分析方法（CLIA）和基于吖啶酯偶联辣根过氧化物酶（HRP）-双特异性抗体的酶联免疫化学发光分析方法（CLEIA），研究表明：基于吖啶酯偶联辣根过氧化物酶（HRP）-双特异性抗体的酶联免疫化学发光分析方法（CLEIA）具有较好的精密度、灵敏度和准确度，在vB12检测方法中，在1-50ng/ml范围内具有良好的线性关系，IC50为6.5ng/ml，最低检测限为0.93ng/ml，vB12在样品中的加标回收率为87.6%~95.6 %，变异系数9.8%~15.5 %；在苏丹红Ⅰ检测方法中，线性范围是0.329-10ng/mL，IC50为1.8ng/ml，最低检测限是0.199ng/mL，苏丹红Ⅰ在样品中的加标回收率为79.3%~108.2 %，变异系数10.2%~14.2 %。由于双特异性抗体在竞争免疫分析中只有一个竞争结合位点，相对于有二个竞争结合位点的单克隆抗体而言，具有灵敏度方面的优势，再加上使用双特异性抗体可同时结合分析物和酶标记物，无需使用酶标记二抗和进行二步反应，具有高效快捷的优势，本研究为提高免疫发光分析方法的灵敏度进行了有益的探索，提供了方法学的新思路，具有较高的科学价值、创新性和应用前景。