甘露消毒丹抗CoxA16/EV71病毒作用机制研究

本项目在既往研究工作的基础上，以中医方剂配伍理论为指导，结合现代医学对手足口病的认识，以甘露消毒丹抗CoxA16/EV71病毒作用及机理为切入点，采用CoxA16/EV71病毒感染小鼠模型、体外细胞培养技术和环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠模型，分别从在体内和离体实验观察甘露消毒丹对CoxA16/EV71病毒感染小鼠的影响、甘露消毒丹体外抗CoxA16/EV71病毒作用和甘露消毒丹对小鼠脾淋巴细胞转化及T细胞亚群影响，探讨甘露消毒丹抗CoxA16/EV71抗病毒作用及其机理，丰富手足口病的研究思路，并为其临床应用及新药开发提供科学依据。

手足口病疫情愈演愈烈，积极寻求有效防治手足口病的方法是刻不容缓的任务，甘露消毒丹是临床治疗手足口病的有效方剂，但关于该方抗手足口病的实验研究尚进行得很少，其机制尚不十分清楚。本项目运用细胞培养技术，从直接抑毒实验、治疗性抑毒实验、预防性抑毒实验、预防+治疗性抑毒实验等4组实验分别观察甘露消毒丹全方及清残方、利残方体外抗EV71病毒的细胞存活率、病毒抑制率以及直接抑毒实验中甘露消毒丹全方及清残方、利残方干预后细胞中miRNA-146a、miRNA-155及TLR4的表达变化，结果发现在直接抑毒实验、治疗性抑毒实验、预防+治疗性抑毒实验中，甘露消毒丹组及清残方组、利残方组均有比病毒唑组更高的细胞存活率及病毒抑制率；清残方组的细胞存活率及病毒抑制率高于利残方组、甘全方组；在预防性抑毒实验中，甘全方组、清残方组、利残方组、病毒唑组的细胞存活率与病毒对照组接近，病毒抑制率几乎为零, 而且甘露消毒丹及其残方均能上调因EV71感染而下降的miRNA-146a、miRNA-155表达，同时下调因感染而上升的TLR4表达；利残方组的调控作用强于清残方组及甘全方组。提示甘露消毒丹及其残方均有较好的抗EV71的作用，并且其抗EV71效应体现在能影响EV71复制的多个环节；清热解毒法在方中发挥了更强的抗EV71作用，但利湿化浊法的作用不能忽视，它与清热解毒法相辅相成；甘露消毒丹能通过调节miR-146a、miR-155及TLR4来调控EV71所致炎症及免疫反应。. 接着以7日龄ICR小鼠在高温、高湿环境中注射EV71病毒造EV71感染模型并使用相应药物干预治疗，观察各组小鼠血清酶（MBP、LDH、CK、NSE）活性，以及IL-10、IFN-γ、TNF-α及IRF3蛋白表达及淋巴细胞亚群。结果发现甘露消毒丹能减少EV71感染小鼠血清中MBP、LDH、CK、NSE的含量，甘全方可能通过降低MBP、LDH、CK、NSE的含量对EV71感染小鼠的组织细胞有一定的保护作用；甘露消毒丹能通过调节脾脏淋巴细胞亚群，显著提高机体抗EV71病毒的免疫功能，诱导IRF3的表达，刺激免疫细胞分泌IFN-γ干扰素提高机体的抗病毒能力，同时又能降低促炎因子TNF-α和提高抑炎IL-10细胞因子的分泌减轻炎症反应。