发酵大豆中抑制乙酰胆碱酯酶活性成分的分离、鉴定及作用机理研究

随着世界人口老龄化趋势的日益严重，目前全世界已有超过2600万名老年痴呆症患者，它已成为继心脏病、癌症、中风之后，导致老年人死亡的第四大病因，而目前其最有效的治疗手段为乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂。如何有效预防和降低老龄人口的患病风险已成为当今社会所面临的严峻问题。申请人在前期的研究中发现，发酵大豆中存在能够抑制AChE的抑制因子，但其有效成分和作用机理尚不清楚。本项目拟以豆豉为试验材料，采用不同极性溶剂依次萃取豆豉中的成分，通过测定其AChE抑制活性，确定其抑制成分的有效极性部位，再利用层析分离技术和生物自显影技术等手段分离各成分，确定有效成分；利用制备液相色谱纯化有效成分，综合运用紫外、红外、质谱、核磁等方法鉴定其分子结构，并考察其对AChE的反应动力学，明确其抑制类型，通过动物实验研究其体内作用机理，为我国大豆资源及其相关食品的开发利用提供理论基础和试验依据。

本项目通过对发酵大豆中乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂的提取分离研究和提取物对D-半乳糖诱导衰老小鼠的干预实验，旨在探索发酵大豆对AChE的抑制作用和机理。主要研究成果和结论如下：.（1）大豆经发酵后较未发酵大豆显著提高了AChE的抑制活性，黑豆较黄豆和脱脂豆粕发酵后具有更强的AChE抑制活性，可作为制备具有相关保健功能食品的原料来源；.（2）建立并优化了超声波辅助提取乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法和工艺条件，乙醇浓度、料液比和超声时间对IC50值的回归数学模型为：IC50=0.041－0.016*A－0.093*B－0.0009250*C＋0.035*A*B＋0.0003500*A*C＋0.006800*B*C＋0.011*A2＋0.093* B2－0.009630*C2.提取工艺的较优条件为：乙醇浓度70%，料液比1︰60，超声时间45min，超声功率140W，超声温度55℃。.（3）发酵大豆中乙酰胆碱酯酶抑制剂的有效极性部位分布范围较宽，在中等和弱极性溶剂中均有存在。.（4）建立了大孔吸附树脂富集乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法和工艺条件，筛选确定了ADS-17大孔树脂为分离乙酰胆碱酯酶抑制剂的树脂，静态吸附率和解析液抑制率分别为96.65%和64.24%。ADS-17大孔树脂适宜的解析液为80%乙醇溶液；静态吸附饱和的树脂以80% 乙醇溶液解析，洗脱速度为1.0mL/min时，洗脱液AChE抑制率达62.64%。.（5）建立了乙酰胆碱酯酶抑制剂生物自显影定性检测方法：酶液浓度：2U/mL（稀释时添加0.5%的牛血清白蛋白）；底物乙酸-α-萘酯浓度：2mg/mL（用50%乙醇溶液），固蓝B盐水溶液浓度：1mg/mL，方法为：硅胶板展开后，彻底挥干溶剂，然后喷酶液并于37℃密闭湿润环境中保温20min，取出稍晾干，再喷乙酸-α-萘酯反应15min左右，喷固蓝B盐显色。.（6）经多种分离纯化方法研究，发酵大豆中乙酰胆碱酯酶抑制剂并非单一组分，推测为不饱和脂肪酸、黄酮等多种成分的综合作用。.（7）发酵大豆提取物的动物实验结果显示：提取物中剂量组具有升高D-半乳糖诱导小鼠的心SOD活力水平的作用及肝肾组织中GSH-Px活力水平的作用，低剂量组具有降低肝MDA活力水平的作用，三个剂量组并均具有升高血中SOD活力水平的作用；提取物可明显升高小鼠脑组织中SOD和GSH-Px活力水平和显著降