剪接体中NTC复合物识别RNA机制研究

Intron removal in premature-mRNA (pre-mRNA) is an essential step in eukaryotic mRNA processing carried out by the spliceosome, a multi-component ribonucleoprotein (RNP) assembly. The NTC complex joins and stays with the spliceosome during the two-step splicing reaction, indicating an important role for this complex in pre-mRNA splicing. The Nineteen Complex (NTC) is formed by the scaffold protein Prp19 and a number of associated splicing factors. Many RNA-protein and RNA-RNA interactions are specified by the NTC complex. Only one protein Cwc2 is capable of binding to RNA. We have reported the structure of the Cwc2 core domain. In this study, we aim at not only the identification of the RNA sequences for Cwc2 binding, but also the elucidation of the RNA-recognition mechanism of Cwc2 by several combined assays. Moreover, we reconstitute core components of the NTC complex in vitro to systematically investigate how the NTC complex regulate RNA-arrangement in spliceosome via Cwc2. Our study will serve as a framework for understanding the regulatory function of the NTC complex in RNA splicing.

在真核生物中前体mRNA成熟的关键一步是前体mRNA的剪接（splicing）。该反应是由被称为剪接体（spliceosome）的巨大核酸蛋白复合物以及许多剪接因子参与的两步转酯反应组成。有一类复合物称为NTC复合物（Nineteen Complex）始终参与剪接体不同过程，表明了该复合物在剪接体组装和催化反应起着极其重要的作用。NTC复合物是由包括Prp19在内的至少10个蛋白组成，仅Cwc2能够结合RNA。我们已经解析报道了Cwc2 的RNA结合核心结构域结构，在此基础上，本项目申请拟进一步鉴定Cwc2结合RNA序列，解析Cwc2-RNA复合物结构，阐述NTC复合物识别RNA机制，并且体外重组NTC复合物核心组分，研究其是如何通过Cwc2来调控剪接体中RNA之间相互作用。该研究能够为剪接体研究领域提供重要的指导作用。

在真核生物中前体mRNA 成熟的关键一步是前体mRNA 的剪接（splicing）。该反应是由被称为剪接体（spliceosome）的巨大核酸蛋白复合物以及许多剪接因子参与的两步转酯反应组成。NTC 复合物（Nineteen Complex）始终参与剪接体不同过程，表明了该复合物在剪接体组装和催化反应起着极其重要的作用。NTC 复合物是由包括Prp19 在内的至少10 个蛋白组成，仅Cwc2 能够结合RNA。我们已经解析报道了Cwc2 的RNA结合核心结构域结构，在此基础上，本项目最初拟进一步鉴定Cwc2 结合RNA 序列，解析NTC复合物结构，阐述NTC 复合物识别RNA 机制，为揭示NTC复合物在剪接过程中的作用提供线索。.本项目执行期中，由于电镜研究技术的飞速发展, 实验室其他研究小组参考我们的研究经验，通过在NTC复合物上添加亲和标签，进而纯化剪接体复合物获得成功，最终于2015年在Science上报道了剪接体复合物的冷冻电镜结构，该结构包括了我们的研究对象NTC复合物结构。.本项目转而研究PPR蛋白家族识别RNA的分子机制。PPR蛋白（Pentatricopeptide Repeat）是新近鉴定广泛存在的一类序列特异性RNA结合蛋白。PPR蛋白发挥功能主要是通过特异性识别线粒体或叶绿体中重要基因的一段RNA序列，来调控各种过程的RNA代谢。PPR蛋白是由多个重复序列单元串联组成。本项目小组获得了PPR10蛋白在未结合RNA和特异结合靶标单链RNA两种状态下的高分辨率晶体结构，清晰地揭示了PPR蛋白特异性识别RNA碱基的分子机理。该文章在Nature杂志2013年12月5日刊出。这是世界上首次对PPR蛋白和RNA复合物结构的报道。.我们还对PPR蛋白-RNA相互作用与自身二聚体形成的关系进行了探索研究，发现PPR10蛋白和RNA复合物的二聚化状态以及PPR10蛋白结合RNA的强度会由氨基端的长度所调控。我们结合复合物结构分析，设计了一种新型PPR结构骨架单元，成功开发出能够分别特异性识别4种碱基的重复序列。根据RNA序列可以设计组装PPR重复单元识别靶标RNA。以上研究为全面理解PPR识别RNA 序列的分子机制提供理论解释； 有助于PPR作为RNA识别工具用于农业和基因工程。