巨噬泡沫细胞源外泌体中microRNA促血管平滑肌细胞增殖的机制研究

在动脉粥样硬化（AS）发生中，巨噬细胞泡沫化参与了血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖过程。研究表明，microRNA（miRNA）可以调节VSMCs的增殖，而细胞分泌的外泌体（exosomes）中含大量miRNA。我们前期实验证明了巨噬细胞泡沫化过程能分泌exosomes，推测巨噬细胞泡沫化过程中分泌的exosomes参与激活VSMCs，其所含的miRNA可能是促进VSMCs增殖的重要因子。本项目拟首先采用荧光标记技术证实exosomes与VSMCs相互作用；进而利用miRNA microarray等技术鉴定筛选exosomes中促VSMCs增殖的miRNA；采用生物信息学和报告基因法预测并验证miRNA靶基因；利用过表达miRNA策略，细胞和分子生物学技术分析miRNA对VSMCs细胞周期或增殖信号通路的影响，探讨miRNA促VSMCs增殖的机制，对于阐明AS发生机制具有重要的理论意义。

动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）发生中，巨噬细胞泡沫化参与了血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）的增殖调控过程。巨噬细胞泡沫化过程中分泌的exosomes可能参与激活VSMCs，其所含的miRNAs可能是调控VSMCs增殖的重要因子。本项目分别利用PMA和Ox-LDL诱导人Thp-1诱导为巨噬泡沫细胞，分离了并鉴定了泡沫化过程中释放的exosomes，结果显示囊泡直径30-100nm，且高表达exosomes标志蛋白CD9和HSP70。利用荧光标记技术证实了exosomes与VSMCs相互作用，共孵育2 h后VSMCs内有明显exosomes荧光，且随时间增加荧光强度增加；利用miRNA microarray技术鉴定筛选出50余种exosomes中差异表达的miRNAs；生物信息学分析认为miR-181a-5p、miR-483-3p、miR-4756-5p与细胞增殖功能有关，确定为进一步研究的对象。利用慢病毒载体过表达和抑制miRNA策略，建立了上述三种miRNAs过表达和抑制稳转VSMCs细胞系。分别利用MTT、EdU法和划痕损伤、transwell法分析过表达和抑制miRNAs后细胞增殖和迁移能力，结果显示：过表达miR-181a和miR-483后显著抑制了细胞的增殖和迁移，抑制miR-181a-5p和miR-483-3p后显著促进细胞的增殖和迁移。生物信息学预测miR-181a-5p可能靶向14-3-3r和S1PR1基因调控细胞的增殖和迁移；miR-483-3p可能靶向CREBL2基因调控细胞增殖。报告基因法和Western blotting技术验证了14-3-3r为miR-181a-5p的靶基因，表明miR-181a-5p可能通过靶向14-3-3r 调控VSMCs的增殖，靶向S1PR1基因调控细胞迁移。上述研究对于丰富细胞-细胞间相互作用和阐明AS发生机制具有重要的理论意义。