Renin-Angiotensin System在介导机械通气所致肺微血管内皮细胞功能障碍中的作用及其机制研究

Mechanical ventilation is a double-edged sword, and providing an effective treatment of respiratory support, it may also lead to further lung injury.For patients with ARDS, when the "protective lung ventilation with low tidal volume strategy is limited, inhibition of the biological damage become necessary treatment measures.In previous work, we found that the tidal volume mechanical ventilation can activate the renin - angiotensin system and led to RhoA activation which is one of the most important signaling molecules in the regulation of endothelial cell permeability.Therefore, this study was to investigate whether the tidal volume ventilation can activate the RAS system through RhoA / ROCK signaling pathway which caused cytoskeletal protein reconstruction and lead to increased permeability of the molecular mechanisms of pulmonary microvascular endothelial cells. The completion of this project will provide new experimental data to reveal the pathogenesis of ventilator-associated lung injury.

机械通气治疗是一把双刃剑，它在提供了一种有效呼吸支持治疗的同时，还可能导致或进一步加重肺部的损伤。对于ARDS患者，当"小潮气量保护性肺通气"策略受到限制时，通过抑制生物性损伤成为必要的治疗措施。在前期工作中，我们发现大潮气量机械通气可以激活肾素-血管紧张素系统(Renin - angiotensin system，RAS)并导致调控内皮细胞通透性最重要的信号分子之一RhoA蛋白的激活；故本课题拟探讨大潮气量机械通气激活RAS系统后是否通过活化细胞内RhoA/ROCK信号转导通路引起细胞骨架蛋白重构，进而导致肺微血管内皮细胞通透性增加的分子机制，为揭示机械通气相关性肺损伤的发病机制提供新的实验资料。

研究背景：机械通气治疗是一把双刃剑，它在提供了一种有效呼吸支持治疗的同时，还可能导致或进一步加重肺部的损伤。探讨其发生机制对有效预防机械性通气损伤具有重要的意义。研究内容：本项目研究了机械通气激活RAS系统后通过活化细胞内RhoA/ROCK信号转导通路引起细胞骨架蛋白重构，进而导致肺微血管内皮细胞通透性增加的具体分子机制。研究方法：动物实验选择ICR小鼠行气管插管并连接呼吸机进行不同潮气量的机械通气，通气结束后收取肺组织标本；肺组织切片HE染色反映肺组织水肿，出血及肺组织病理学改变，支气管肺泡灌洗液观察细胞数量和蛋白浓度的变化；采用ELISA试剂盒检测机械通气后小鼠血浆中Ang-2的含量；采用免疫组化半定量分析肺组织中Ang-2、RhoA 与ROCK的变化；采用western blot、RT-PCR等方法检测细胞骨架微管的变化等。细胞实验选择原代培养小鼠肺血管内皮细胞对在体实验进行验证，观察经RhoA/ROCK特异性抑制剂预处理后，Ang-2对血管内皮通透性、应力纤维形成与分布的影响及其与RhoA/ROCK通路之间的关系。重要结果：大潮气量机械通气可引起肺组织病理损伤以及支气管肺泡灌洗液中的细胞数量和蛋白浓度明显升高；低潮气量组和高潮气量组小鼠血浆中的Ang-2水平均显著增加，这种变化具有时间依赖性；且随着机械通气潮气量的增加，肺组织Ang -2含量亦增加；其变化趋势与RhoA/ROCK之间存在正相关关系。机械通气后肺组织微管稳定性下降，微管保护剂Taxol可显著减轻机械通气诱导的W/D升高和伊文思蓝通透性增加以及抑制NLRP3炎性小体激活。细胞实验表明Ang-2可以激活RhoA/ROCK信号通路，继而影响MLC激酶，通过使其磷酸化失活而引起应力纤维F-actin的变化最终导致肺微血管通透性增加。科学意义：本研究通过运用分子生物学技术，在模型动物及细胞层面证实了肺组织机械性损伤后可以激活RAS系统，RAS系统继而通过RhoA/ROCK信号转导通路引起肺部水肿的具体分子机制，本课题的完成为揭示机械通气相关性肺损伤的发病机制提供了新的实验资料。