基于代谢组学方法研究pksCT和ctnG单、双基因缺失对红曲菌代谢产物的影响

红曲菌代谢产物中桔霉素的发现，使得红曲菌发酵产品在食品和药品中的应用受到了质疑，也使得桔霉素的代谢通路研究成为热点和难点。本课题组采用分子生物学技术对红曲菌生物合成桔霉素相关基因进行研究时，发现敲除红曲菌pksCT和ctnG单、双基因后，红曲菌产桔霉素能力明显下降，同时产生新的代谢产物。本项目拟在前期工作基础上，采用代谢组学方法探讨橙色红曲菌和红色红曲菌的pksCT和ctnG单、双基因缺失株与原始菌株代谢表型的差异；比较两种红曲菌的pksCT和ctnG单、双基因缺失后代谢组分变化的异同；并对红曲菌pksCT和ctnG基因缺失后产生的新代谢产物的结构进行表征；以期得到红曲菌pksCT和ctnG基因功能相关的生物标志物，了解生物标志物的相互联系、细胞内代谢转化途径。研究结果将进一步认识红曲菌pksCT和ctnG基因功能和桔霉素的合成机制, 为进一步对桔霉素生物合成相关基因进行敲除提供指导。

红曲菌产桔霉素的问题,限制了其广泛的应用.本项目以红曲菌及其pksCT和ctnG基因缺失株为研究对象，考察了红曲菌的原始菌株及其基因缺失在不同培养基条件下产桔霉素和色素的差异变化，并建立了几种红曲菌代谢产物检测方法。采用GC-TOF-MS等方法研究了原始菌株和基因缺失株的代谢组分的差异，得到原始菌株和基因缺失株的代谢指纹图谱，采用多元变量数据统计分析方法对所得到的相关数据进行统计和分析，得到基因缺失株与原始菌株之间的系列差异代谢物，并对差异代谢物之间的相关联系进行了分析。结果表明：pksCT和ctnG缺失后主要影响桔霉素和色素的产量，其中pksCT基因缺失株桔霉素产量降低了约98%，而色素产量明显增加，ctnG基因缺失株桔霉素产量约50%，色素产量有所降低。代谢组学研究结果确定了85种化合物，而pksCT基因缺失与原始菌不同发酵阶段之间差异代谢物主要有18种包括2-羟基丁酸、苯丙氨酸、肉豆蔻酸、果糖、异肌醇，肌醇等，分析了这些代谢物的相互关联。另外发现只有红曲菌AS3.4384的pksCT基因缺失菌株中两种含量较高的黄色荧光色素，并对该产物进行了分离和纯化，并鉴定了两种新的黄色荧光色素的结构，两者具有相似的结构，其差别在侧链相差两个亚甲基，并与橙色素(红斑红曲素与红曲玉红素)类似，其结构式分别为C22H26O6 和 C24H30O6，其中羟基和甲氧基取代了红斑红曲素和红曲玉红素中的共轭酮羰基。同时发现在YES培养基中红曲菌AS3.4384的pksCT缺失后产生无色代谢产物，而红曲菌AS3.4384和ctnG基因缺失株未发现这两种代谢产物，并分离、纯化和鉴定了其结构，结果表明这两种无色代谢物含吡啶结构，结构式分别为C21H25O4N和C23H29O4N，且两种无色化合物具有一定的细胞毒性。研究结果为进一步了解桔霉素的合成相关基因提供一定的帮助.