AbfR调控表皮葡萄球菌生物膜形成的分子机制研究

Staphylococcus epidermidis is a coagulase-negative and opportunistic pathogen, which normally inhabits human skin and mucous membranes. Along with indwelling medical devices are performed on patients, S.epidermidis ranks fourth among the most important nosocomial pathogens. The protective effect of biofilm in S.epidermidis increased multi-antibiotics resistance, and ultimately lead to the failure of implanted medical devices. Consequently, S. epidermidis infection has become a widespread troublesome problem as they are extremely difficult to treat, and represents a serious burden for the public health system..In our previous work , We identified the first oxidation-sensing regulator AbfR in S.epidermidis.Our results demonstrated that AbfR is involved in biofilm formation, evidenced by the loss of antibiotic resistance of S.epidermidis in the abfR mutant. Therefore, AbfR is likely to be applied as a new antibacterial drug target. To achieve this, it is necessary to decipher the molecular mechanism of AbfR regulating biofilm formation..We are motivated to integrate multiple methods of proteomics, molecular biology and microbiology to evaluate signaling pathways of biofilm formation which affected by AbfR, and to decode the regulation mechanism of cysteine phosphorylation of AbfR. This project will deepen the understanding of the potential novel antibacterial target, thus providing theoretical basis for the specificity screening of small molecule inhibitors used for the design of antibacterial drug.

表皮葡萄球菌（简称表葡菌）是一种在人体皮肤和粘膜表面广泛存在的凝固酶阴性的条件致病性菌。随着各类植入性材料在临床上的广泛应用，表葡菌已经成为引起医院内感染的前四位病原体之一，因其生物膜的保护作用，易发生多重耐药难以治疗，最终导致医疗材料植入的失败，造成巨大的经济损失。. 前期工作中，我们鉴定了表葡菌中一个全新的与多重耐药性相关的转录因子AbfR。研究发现AbfR缺失能影响生物膜的形成从而使表葡菌丧失耐药性，因此AbfR很可能成为一个新型抗菌药物靶标，但是AbfR影响生物膜形成的分子机制仍有待进一步研究，这对开发积极有效的抗菌药物十分关键。. 本项目拟综合蛋白质组学、分子生物学、病原细菌学等多种学科手段深入研究转录因子AbfR影响表葡菌生物膜形成的相关信号通路及其基于活性半胱氨酸的磷酸化的转录调控机制，更加详尽地了解这一潜在的新型抗菌靶标，进而为小分子抑制剂的特异性筛选提供理论依据。

前期工作中，我们鉴定了人体重要致病菌表皮葡萄球菌（表葡菌）中一个全新的与多重耐药性相关的转录因子AbfR。研 究发现AbfR缺失能影响生物膜的形成从而使表葡菌丧失耐药性，因此AbfR很可能成为一个 新型抗菌药物靶标，但是AbfR影响生物膜形成的分子机制仍有待进一步研究，这对开发积 极有效的抗菌药物十分关键。 .本项目的主要研究内容和重要研究成果总结如下:.1).我们通过X射线晶体衍射的方法解析了AbfR在还原状态，和过氧化成亚磺酸与磺酸状态下形成DNA复合物的晶体结构，并进一步解析了AbfR形成双二硫键氧化态的晶体结构。.2).结合多角度的生化分析，我们的结果证明了AbfR基于活性半胱氨酸氧化还原传感调节的两个全新机制：（i）二硫键形成的可逆化学修饰能够显著消除AbfR结合DNA的能力，而不可逆转的过氧化修饰则无法消除AbfR的阻遏抑制效应；（ii）不论是单二硫键交联型还是双二硫键交联型的AbfR二聚体都具有重要的生物学意义。AbfR的过氧化修饰虽然与还原态的构象相似并保持了与DNA结合的能力，但并不具有生物学浓度相关性。单二硫键交联型AbfR仅有微弱的DNA结合能力。双二硫键交联型则采用了与DNA结合完全不相容的“开放”式构象。.3).ChIP-seq分析表明AbfR能直接结合表葡菌基因组上的148个基因座。采用定量蛋白质组学方法比较野生型，AbfR基因敲除和基因回复等三种菌株的蛋白质组变化，我们总共鉴定到了1581种蛋白质（高达全基因组的64%）,其中302个蛋白的表达在AbfR敲除菌株中发生了显著变化，包括133个下调蛋白和169个上调蛋白。这些差异蛋白参与了表葡菌生物膜形成的多条重要生物通路。实时荧光定量PCR和凝胶迁移率实验确证了gapA2和pdhA两种差异蛋白，进一步揭示了AbfR在糖酵解途径中的直接调节作用。此外，我们还证明了AbfR采用氧化传感机制来调节关键DNA修复蛋白MutS，以抵御表葡菌中的ROS损伤。.总之，这个项目详尽地研究了AbfR这一潜在的新型抗菌靶标的功能和作用机制，为将来的小分子抑制剂的特异性筛选提供理论依据。