DNA甲基化转移酶1在小鼠表皮干细胞衰老中的作用和机制研究

干细胞衰老是机体衰老的重要特征。目前认为表观遗传调控是干细胞衰老调控的主要机制之一。DNA甲基转移酶1（DNMT1）是重要的表观遗传修饰酶，在体细胞衰老和干细胞分化中均起重要作用。我们的前期工作构建了表皮特异性DNMT1基因敲除鼠，发现突变鼠皮肤有明显的早衰表型，且其表皮标记滞留细胞数量明显减少，表明DNMT1可能在表皮干细胞的衰老过程中起重要作用。本研究我们将以表皮特异性DNMT1基因敲除鼠为研究对象，首先分离培养不同月龄小鼠表皮干细胞，研究DNMT1对其衰老等生物学特性的影响；然后用RNAi等方法明确DNMT1与DNMT3b或HDACs共同沉默对表皮干细胞衰老的影响；再用Chip等方法明确DNMT1调控Bmi1在干细胞衰老中的作用；最后利用高通量DNA甲基化检测法筛选衰老相关靶基因并研究其功能，旨在探讨DNMT1在表皮干细胞衰老中的作用机制，为干细胞衰老研究领域和临床干预提供理论依据。

项目背景.随着老龄化社会的到来，衰老的研究已成为生命科学领域的重要课题。皮肤衰老是机体衰老最直观的表现，近年来关于皮肤衰老机制的探索已越来越成为研究的热点，其中皮肤衰老的表观遗传学调控机制逐渐引起研究者的普遍关注。DNA甲基转移酶1（DNMT1）是维持甲基化的关键酶，它的主要功能是维持DNA复制后的甲基化状态，并在细胞有丝分裂时将甲基化传给子代。它参与了胚胎发育、肿瘤发生时抑瘤基因的异常沉默等多种生物学过程。既往研究表明DNMT1在细胞复制性衰老中也发挥了重要作用，但DNMT1是否参与皮肤的衰老进程，其具体机制如何，目前尚不明确。我们的早期研究提示，DNMT1可能参与了小鼠表皮干细胞及皮肤的衰老过程。.主要研究内容.1.分离培养了正常初生小鼠（0月龄）及12月龄小鼠表皮干细胞，采用Western Blot（WB）法及β-半乳糖苷酶染色检测不同月龄小鼠表皮干细胞DNMT1的表达及衰老相关指标变化；.2.利用甲基化芯片测序比较了曝光与非曝光部位皮肤组织DNA甲基化改变的基因，筛选出可能受DNMT1调控的下游基因AKT2；.3.分离培养了正常人皮肤成纤维细胞（NHSFs），利用UVA照射构建光老化细胞模型。再行慢病毒转染成功构建不同DNMT1表达量的NHSFs稳定细胞株。随后行β-半乳糖苷酶染色、WB和RT-PCR等技术检测衰老相关指标及光老化过程中DNMT1水平的变化；4.利用RNA干扰等方法探讨AKT2在DNMT1调控NHSFs光老化时扮演的角色。.重要结果及关键数据.1.随着小鼠月龄增长，小鼠表皮干细胞干性逐渐丧失，并出现衰老表型，DNMT1含量亦降低；.2.通过DNA甲基化芯片筛选曝光与非曝光皮肤组织中DNA甲基化变化的基因，发现AKT2变化较为明显；.3.小剂量UVA重复3天辐射NHSFs，可诱导细胞衰老，此时细胞内DNMT1含量降低，AKT2及磷酸化的AKT2（pAKT2）均升高，两者的变化趋势呈负向相关；在光老化细胞中恢复DNMT1的水平或是抑制AKT2水平均能延缓细胞衰老的发生；在正常细胞中人为敲低DNMT1会导致AKT2及pAKT2含量升高，细胞随之发生早衰，在此基础上利用siRNA抑制AKT2后，细胞的衰老表型可被部分逆转。.科学意义.证明了DNMT1与小鼠表皮干细胞的衰老相关。明确了DNMT1可以通过调控AKT2从而参与UVA所致的NHSFs光老化。