子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞基因去甲基化的差异性蛋白质组学研究

在总结前人与自身工作基础上，我们假设：在相同的细胞内若干基因发生相同区域去甲基化，不会偶然、孤立存在，还可能影响其他多种重要基因发生类似改变。为此，拟在确诊子宫腺肌病异位子宫内膜组织中，分离其内膜间质细胞，确认存在14-3-3ζ等基因启动子区域去甲基化及特征性生物学功能改变后，采用蛋白质组学技术，筛选与鉴定差异表达之蛋白，绘制相应MAP图；选择一个典型差异性高表达，非14-3-3ζ、SF1受体与ER-β受体且其基因相同区域存在去甲基化蛋白X，采用RNAi腺病毒载体技术，建立相应pSilencer-X细胞株；检测其细胞增殖率、迁移率、细胞周期及凋亡情况；将相应的母本细胞及转基因细胞，分别接种至人工控制周期的裸鼠背部，观察接种细胞的生长、增殖与浸润情况，以求阐明差异性高表达蛋白X在子宫腺肌病组织间质细胞中的意义，为深入了解子宫腺肌病发生、发展过程的分子生物学机制，奠定良好的理论与实验基础。

子宫腺肌病主要发生于育龄妇女，且经产妇多见。近年来国内外文献报道其发病率有明显上升趋势，已成为人们日益重视的妇科常见病、多发病。其发病机制复杂，学说甚多，至今未成定论。课题组总结、分析前人工作，并结合自身前期工作基础，在发现确诊子宫腺肌病临床病理组织中，14-3-3ζ亚型mRNA与蛋白显著上调，其基因启动子区CpG岛存在去甲基化状态。本项目分离纯化、培养了子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞（ESCs），RT-PCR及WB验证14-3-3ζ、SF1、ER-β的mRNA及蛋白表达，MSP验证三者的启动子区甲基化状态；二维蛋白电泳及质谱检测子宫腺肌病异位ESCs中的差异表达蛋白；选取3-5个典型高表达的蛋白在间质细胞中验证，RT-PCR及WB验证其 mRNA及蛋白表达水平，飞行时间质谱检测其基因启动子区甲基化情况；采用基因克隆及转基因技术，建立相应的转基因细胞，分别检测其细胞增殖率、迁移率、细胞凋亡及周期情况。将相应的母本细胞及转基因细胞，分别异位接种至人工控制生理周期的裸鼠背部皮下，观察接种细胞的生长、增殖等情况。.结果发现：1）在临床确诊子宫腺肌病病理组织中分离纯化、培养的子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞（ESCs），RT-PCR及WB检测到14-3-3ζ、SF1、ER-β的mRNA及蛋白表达均上调，MSP检测到三者的启动子区均存在去甲基化状态；2）二维蛋白电泳及质谱检测到差异表达蛋白32个，其中子宫腺肌症间质细胞中表达上调点19个，表达下调点7个，仅在子宫腺肌症间质细胞中表达点4个，缺失点2个；3）选取典型高表达的蛋白PDRX4、TGM2及LASP1在间质细胞中验证，RT-PCR及WB发现在异位子宫内膜间质细胞中PDRX4、LASP1 mRNA及蛋白表达水平显著上调，TGM2 mRNA及蛋白表达水平显著下调，飞行时间质谱检测结果显示在异位子宫内膜间质细胞中LASP1基因启动子区存在异常去甲基化情况；4）检测到LASP1转基因细胞ESCs的增殖率及迁移率要显著低于对照ESCs，细胞凋亡情况显著高于对照ESCs；5）裸鼠皮下接种4周后，监测接种组织生长情况，结果表明： LASP1转基因细胞来源组织体积较对照转基因细胞来源组织体积更小。.本课题基本完成预期研究计划，培养硕士生3名，研究成果正在整理发表中。