少量细胞DNA表观遗传修饰的LC-MS分析新方法

DNA modifications such as 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine, and N6-methyladenine, as important epigenetic marks, play important roles in many critical biological processes，such as gene expression regulation, cell fates, embryonic development and cancers. Genomic DNA modifications analysis is an important means to understand embryonic development, adult stem cells, and tumor heterogeneity..However, the number of germ cells, early embryos, and adult stem cells that can be obtained is very limited, an analytical method for a small number of cells (<100 cells) that with high sensitivity and high selectivity is needed. The method of liquid chromatography-mass spectrometry for DNA modification is considered as the "gold standard" for quantification of DNA modification levels for its specificity, sensitivity and accurate quantitation. However, the use of liquid chromatography-mass spectrometry for the analysis of DNA from small number of cells is yet with challenge. This study aims to establish a non-polluting DNA extraction and enrichment method by screening suitable DNA adsorbent materials, eliminating potential contaminations and interferences during processing, which may occur within the cells and outside of cells, and at the same time, to develop a highly sensitive LC/MS method to detect DNA modifications using a small number of cells (<100 cells). This project will provide an important method for measurement sciences, life sciences, chemical biology and epigenetic study.

由酶催化形成的DNA修饰如5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，是表观遗传学研究的化学基础，在很多非常重要的生物学过程中发挥着不可或缺的作用。基因组DNA修饰分析是理解胚胎发育、成体干细胞、肿瘤异质性的重要手段，而研究中能获得的生殖细胞、早期胚胎、成体干细胞等数量非常有限，亟待发展针对少量细胞（<100 细胞）的高灵敏、高选择性DNA表观修饰的分析技术和方法。虽然液相色谱-质谱法分析DNA修饰的方法被认为是DNA修饰水平定量的“金标准”，但是，由于原核生物的广泛存在和质谱离子化方式的限制，液相色谱-质谱法应用于少量细胞DNA修饰分析依然存在很大挑战。本研究拟通过筛选适合的DNA吸附材料、消除各个过程中的干扰，建立微量DNA的提取、富集和小体积酶解方法，同时，建立高灵敏度的液质联用方法，实现对少量细胞（<100 细胞）DNA修饰高灵敏度分析，为生命分析化学提供新技术。

DNA修饰如5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，是表观遗传学研究的化学基础，在很多非常重要的生物学过程中发挥着不可或缺的作用。基因组DNA修饰分析是理解胚胎发育、成体干细胞、肿瘤异质性的重要手段，而研究中能获得的生殖细胞、早期胚胎、成体干细胞等数量非常有限，亟待发展针对少量细胞（<100 细胞）的高灵敏、高选择性DNA表观修饰的分析技术和方法。液相色谱-质谱法分析DNA修饰的方法被认为是DNA修饰水平定量的“金标准”，但是，由于原核生物的广泛存在和质谱离子化方式的限制，液相色谱-质谱法应用于少量细胞DNA修饰分析依然存在很大挑战。本项目通过筛选适合的DNA吸附材料、消除各个过程中的干扰，建立微量DNA的提取、原位富集和酶解酶解方法，同时，建立高灵敏度的液质联用方法，实现对少量细胞（低至20 个细胞，或单个斑马鱼早期胚胎）DNA修饰高灵敏度分析。为解决微量细胞样品DNA提取过程盐残留抑制DNA酶解，而导致DNA修饰定量偏差问题，建立了一种基于超高活性DNase I工程酶酶解的LC-MS/MS分析方法，利用超高活性DNase I工程酶，在高盐条件下通过DNA的高效酶解，实现5mC及其他酶解受限DNA修饰的准确定量。建立了亚染色质DNA分级分离和DNA修饰分析的方法。此外，发展的高灵敏度DNA修饰分析方法应用于研究哺乳动物基因组N6-甲基腺嘌呤（6mA）修饰研究，结合代谢依赖的同位素标记，在小鼠胚胎干细胞中识别到DNA聚合酶掺入的6mA新来源。上述成果发表于Analytical Chemistry 2篇（IF 8.008,第一标注），Photochemistry and Photobiology 1篇（IF 3.421 第一标注）， Cell Research 1篇 (IF 46.29, 第二标注），中文核心期刊《分析科学学报》 1 篇（第一标注）