组织蛋白酶Cathepsin L/V调控巨噬细胞焦亡在动脉不稳定斑块中的作用和机制研究

Recent studies have shown that macrophage pyroptosis can lead to hyperactivation of inflammation, which is a key factor in promoting the progression of atherosclerosis. Cathepsin L/V is involved in atherosclerosis, and closely related to plaque vulnerability. In our previous work, we have systematically studied the expression, secretion and glycosylation of Cathepsin L/V. Our work suggested that Cathepsin L/V could mediate cardiovascular aseptic inflammation, and the preliminary data indicated that Cathepsin L/V deletion could significantly inhibit macrophage pyroptosis induced by ox-LDL. In the current project, we propose that Cathepsin L/V can enhance macrophage pyroptotic pathway in both the “priming” and “activation” ways, thus overactivate the inflammation in atherosclerotic lesions, promote the formation of unstable plaque and finally lead to the occurrence of cardiovascular events. We will carry out a series of studies in cellular and molecular levels, mouse models, and clinical specimen. We will confirm the roles of Cathepsin L/V in regulating macrophage pyroptosis and its implication in the formation of unstable atherosclerotic plaques, and elucidate the related molecular mechanisms. Our work is promising to provide novel targets and strategies for the prevention and treatment of unstable atherosclerotic plaque and reducing the risk of cardiovascular events.

近期研究表明巨噬细胞焦亡可引发炎症过度激活，是促进动脉粥样硬化进展的关键因素，组织蛋白酶Cathepsin L/V亦参与动脉粥样硬化过程，与不稳定斑块密切相关。本课题组在前期工作中系统研究了Cathepsin L/V的表达、分泌和糖基化特点，并发现其可介导心血管无菌性炎症，相关预实验结果提示Cathepsin L/V缺失可显著减轻氧化低密度脂蛋白所致的巨噬细胞焦亡。在本课题中，我们提出Cathepsin L/V通过“预激”和“激活”两方面的途径正向调控巨噬细胞焦亡通路，引发局部炎症过度激活，促进不稳定斑块形成以及心血管事件发生。我们将从细胞和分子水平，小鼠模型，临床标本等三个层面开展一系列研究，证实Cathepsin L/V在巨噬细胞焦亡和不稳定斑块形成中的作用，并阐明相关的分子机制，为临床防治不稳定斑块及降低心血管风险提供新的干预靶点和策略。

项目背景：动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS) 是心血管疾病的重要基础性病变，近期研究表明巨噬细胞焦亡可引发炎症过度激活，是促进动脉粥样硬化进展的关键因素，组织蛋白酶CTSL/V亦参与动脉粥样硬化过程，与不稳定斑块密切相关。CTSL/V是否通过调控巨噬细胞焦亡促进不稳定斑块形成，尚有待进一步研究。.主要研究内容： 探讨CTSL/V的表达、分泌和糖基化特点；以腺病毒载体上调CTSV表达观察其是否可促进ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡通路的激活；以siRNA下调CTSV表达或使用CTSL/V 抑制剂观察其是否可抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡通路的激活；在小鼠模型中验证在AS病变中CTSL 表达上调以及巨噬细胞焦亡通路过度激活；在临床标本验证CTSV 上调和巨噬细胞炎性小体激活及焦亡启动与不稳定斑块相关。.重要结果：1）CTSV具有独特的表达和糖基化模式，CTSV没有单链形式，其前体可有不同的糖基化水平。2）CTSV的前体链形式（Pro-CTSV）可主动分泌至细胞外，而且其分泌可能是通过循环内吞小体。3）CTSV的糖基化与其正常转运、切割、活化和分泌相关，而且N221位点的糖基化比N292位点更具决定性作用。4）CTSL/V的前体形式与TLR4有交互作用。5）CTSL缺失可减轻ox-LDL所致的LDH释放。6）LPS+ATP及LPS+尼日利亚菌素诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）焦亡，且出现Caspase-1和GSDMD剪切活化 7）在AS病变中存在CTSL/V过表达，抑制CTSL/V活性可延缓AS进展。.结论及科学意义：1)本项目首次系统阐明CTSL/V的表达、分泌及糖基化特点，其前体链和重链都存在糖基化修饰，其分子结构中包含N221和N292两个糖基化位点，且N221位点糖基化与CTSV转运及活化相关。2) CTSL/V 通过促进巨噬细胞炎症小体激活，引发巨噬细胞焦亡以及血管炎症过度激活，从而促进AS不稳定斑块形成及发展，可能为临床AS不稳定斑块的诊疗提供新的生物标记物和干预靶点。