CDKL5与表观遗传调节分子在脑神经元发育和突触可塑性中相互作用研究

人类CDKL5基因突变引起与神经发育性遗传病Rett综合征重叠的表型，提示其可能在神经系统发育和功能调控中起重要作用。甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）和DNA甲基化转移酶1（Dnmt1)，是表观遗传学中DNA甲基化调控基因表达的二个重要分子。体外研究发现，CDKL5作为蛋白激酶，可直接作用于MeCP2和Dnmt1，使其磷酸化。本研究从CDKL5与MeCP2和Dnmt1之间的相互作用入手，探讨CDKL5是否通过MeCP2和Dnmt1相互作用参与及如何参与脑神经元发育中基因表达和功能调控，拟用RNA干扰建立CDKL5基因表达下调的体外培养鼠大脑皮层神经元模型，用分子细胞生物学技术观察CDKL5基因表达抑制后，神经元发育、活力状态、突触可塑性及相关基因甲基化状态和表达变化，以阐明CDKL5基因功能及与MeCP2和Dnmt1的关系。同时临床鉴定基因突变谱，建立基因型与表型关系将有助了解基因功能

以培养大鼠大脑皮层神经元为模型，研究神经元发育过程中CDKL5、MeCP2和Dnmt1基因表达的动态变化和相互作用。免疫荧光双标记鉴定培养不同时间神经元纯度及形态，选培养第1、4、7、11、15和19天，用实时定量PCR方法检测mRNA变化，显示CDKL5在4和7天高表达，第4天达峰值，此后逐渐降低；MeCP2第4天表达最高，此后逐渐降低；Dnmt1第1天表达水平最高，其后逐渐降低。相同时间Western blot方法检测三者在蛋白水平表达，显示CDKL5表达量逐渐增高，第19天达最高峰，但不显著；MeCP2表达逐渐升高，第11天达高峰，随后逐渐下降；Dnmt1于培养第1天表达最高，此后逐渐下降。三分子在蛋白水平的表达量变化与mRNA不完全一致。CoIP证实三分子相互作用、相互结合并以蛋白复合体形式行使功能。二、利用表达大鼠CDKL5基因siRNA慢病毒载体，建立CDKL5基因表达下调神经元模型，研究其表达下调后MeCP2和Dnmt1表达及蛋白磷酸化状态的变化等。建立稳定CDKL5表达下调神经元模型，确定最佳病毒，MOI=6以上RNAi干扰效率高。以cck 8方法检测神经元的活性在第11天达高峰，其后逐步下降。转染时间在神经元培养第8天，继续培养3天后，连续4天用real-time PCR方法检测CDKL5基因表达下调后大鼠皮层神经元CDKL5表达量随着转染天数递增而降低；Mecp2先降低，随后增高；Dnmt1先降低，然后增高，最后再下降。Annexin Ⅴ方法检测神经元在CDKL5表达下调后期凋亡率相对增加一倍。三、临床相关CDKL5突变分析：收集符合标准患儿102例，男31，女71例。表型①早发性脑病64例，包括婴儿痉挛症36例，Ohtahara 综合征8例，余不能归类；②出生6月无原因惊厥；③Rett 综合征（RTT）38例，MECP2无突变。其中典型RTT16例；先天性10例；保留语言变异型3例和Hanefeld综合征9 例。先用PCR-DNA测序检测CDKL5突变；未检出者用MLPA检测是否存在外显子重复或缺失。检出突变10例，点突变、小缺失或插入。女性患儿X-染色体均为随机失活。表型婴儿痉挛症1例男性；Hanefeld综合征6例；早发性脑病3例。结论：CDKL5突变是引起女性早发惊厥型癫痫的重要原因之一。