利用组织特异性ECM高质量扩增牙周膜干细胞并促进其定向分化的研究

牙周炎严重危害人们的健康。目前，对于牙周炎的传统治疗方法尚不能产生理想的牙周组织再生效果。牙周膜干细胞的发现为攻克这一疾病带来了曙光。然而，对于如何在体外大量扩增PDLSCs以满足临床需要，同时又要保持其干细胞特性，尚未有有效解决方案；同时，对于如何精确调控PDLSCs的定向分化，还没有明确答案。本项目在前期工作的基础上，针对以上两方面亟待解决的问题，以微环境对于干细胞的调控为着眼点，利用独特的ECM模型构建牙周组织基质微环境，并结合生长因子微环境，拟实现PDLSCs的高质量扩增和定向分化，并利用细胞聚集体技术和"分层构建、整体复合"策略进行动物体内异位牙周组织工程构建，以期达到深入探究微环境与干细胞的相互关系、为解决牙周组织工程瓶颈问题提供有效方案、为今后向临床应用转化奠定理论依据的目的。

牙周膜干细胞（hPDLSCs）被认为是牙周组织稳定和修复再生的细胞学基础。然而，如何在体外大量扩增出高质量的hPDLSCs，且精确控制hPDLSCs的生长与分化，已成为实验室到临床应用转化中亟待解决的关键问题。微环境对于干细胞特性的维持和分化起着重要的调控作用。因此，我们将牙周组织细胞外基质作为调控的着眼点，首次构建牙周组织特异性细胞外基质，包括牙周膜细胞来源ECM和颌骨骨髓来源ECM（hPDLCs–ECM及hBMCs-ECM），分析两种ECM的结构与蛋白组成差异，研究两者对于hPDLSCs增殖与凋亡的影响，探究其对于维持hPDLSCs干细胞特性的作用，以及对于hPDLSCs体外、体内定向分化的影响。 研究结果如下：1.两种不同来源的ECM模型，内部细胞结构消失，但胶原骨架结构基本完整，两者基质表面结构有所不同，hPDLCs–ECM胶原纤细，而hBMCs-ECM胶原粗大。2.细胞外基质蛋白成分保留基本完整，两种ECM的构成蛋白有明显差异性，hBMCs-ECM或表达更多的成骨特异性蛋白。3.与对照组相比，hPDLCs-ECM与hBMCs-ECM均能显著促进hPDLSCs增殖，但对凋亡的影响与对照组无明显差异。4..接种在两种组织特异性ECM上的hPDLSCs的克隆形成率均明显高于对照组，经过多次传代之后，ECM上培养的hPDLSCs仍保持较高的克隆形成能力。接种在两种组织特异性ECM上的hPDLSCs经多次传代之后的成骨成脂分化能力也明显高于对照组。5.hPDLSCs和hBMCs-ECM、hPDLCs-ECM共培养后与无机牛骨粉混合，植入裸鼠皮下，在hBMCs-ECM组生成了类似骨质和牙周膜纤维样结构，hPDLCs-ECM组生成牙周膜样纤维，含大量的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原，对照组仅有疏松的纤维结缔组织生成，主要为Ⅰ型胶原。 研究结论如下：本研究成功制备出了牙周组织特异性ECM，即hPDLCs–ECM与hBMCs-ECM，进一步明确了其结构，并对其中的蛋白成分进行了分析。我们发现hPDLCs–ECM及hBMCs-ECM均能促进hPDLSCs的增殖，保持干细胞的特性，对干细胞的凋亡没影响，促使hPDLSCs在体内生成类骨质和牙周膜样纤维结构。本研究为探究牙周组织微环境对牙周膜干细胞的生长与分化提供了有效的细胞外基质微环境模型，为获得体外高质量扩增hPDLSCs提供了新思路。