泛素C在辐射损伤与防护中的作用及机制研究

我们在已结题的国家自然基金项目的研究中发现：青蒿素衍生物能提高P53突变型细胞的放射敏感性，而不影响P53野生型细胞的放射敏感性；引起不同细胞放射敏感性差异的原因是青蒿素衍生物不能上调P53突变型细胞泛素C的表达，但能诱导P53野生型细胞泛素C的高表达；泛素C高表达能提高细胞损伤修复能力。本项目拟选择P53突变/野生/缺失型细胞，在构建泛素C高/低表达细胞株，转染P53野生型或不同突变体的P53质粒的基础上。观察青蒿素衍生物对照射细胞泛素表达的影响；检测泛素C表达水平对细胞放射敏感性的影响；分析胞外游离泛素对细胞和动物放射敏感性的影响；寻找P53泛素化位点及P53泛素化在放射应答中的作用。旨在揭示青蒿素衍生物对P53突变/野生型细胞放射增敏差异的机理；探索P53对泛素C的调控机理；明确泛素C表达水平对细胞放射敏感性的影响机制；寻找P53泛素化位点；探讨游离泛素分子对辐射损伤与防护的作用机制

（一）泛素作为肺癌放射增敏靶点的研究。1.检测肺癌及癌旁组织中泛素蛋白表达。泛素蛋白在肺癌组织中的表达量明显高于癌旁组织（P<0.001）。2.成功构建并表达抑制泛素基因表达的shRNA-UBB、shRNA-UBC质粒。二者联合作用对p53缺失型H1299细胞中泛素蛋白水平抑制作用更明显（抑制率为76%）。3.泛素表达水平对肺癌细胞辐射敏感性的影响。（1）shRNA-UBB、shRNA-UBC联合作用，对人非小细胞肺癌H1299、A549细胞有增殖抑制作用，其对p53缺失型H1299细胞增殖的抑制作用较p53野生型A549细胞显著；（2）p53缺失型H1299细胞Ub-KD（shRNA-B4/C2）的放射敏感性增加，Ub-KD对p53野生型A549细胞不具有放射增敏作用。4. Ub-KD放射增敏的机理。下调泛素表达增加诱导（3、6 Gy）X射线照射后H1299细胞的G1期阻滞，降低辐射诱导H1299细胞DNA损伤修复能力，抑制NF-κB活化及转入胞核内NF-κB蛋白水平降低； 5. 泛素表达水平对裸鼠体内移植瘤放疗效果的影响。（1）Ub-KD联合照射的H1299细胞裸鼠移植瘤体积明显小于照射组（P<0.05）。（2）沉默泛素的shRNA质粒能在体内表达。.（二）游离泛素的辐射防护作用的研究。1．小鼠血清中free UB浓度随着照射剂量和照后时间的延长而增加。2．7 Gy X射线照射后1、3、7、15天恒河猴血清中free UB表达量增加（P < 0.01）。3．肿瘤病人放疗后血清中free UB的表达量明显增加。4．7 Gy X照射后，小鼠辐射敏感组织（小肠、脾脏）中free UB表达量均明显增加，而辐射不敏感组织（心、肝、肺、肾）中free UB表达量无明显变化。5．辐射提高小鼠小肠中free UB编码基因UBB mRNA表达量（72.6%），而同一小鼠心脏匀浆中free UB编码基因UBB mRNA表达量无明显变化。6．Free UB可明显提高照射后辐射抗性C57小鼠的存活率。7．Free UB可减轻小鼠骨髓的辐射损伤、对免疫系统具有辐射防护作用，同时，可加快小鼠小肠辐射损伤的恢复。8. Free UB对辐射损伤防护作用的机制。表达谱芯片结果表明，Free UB可通过多种代谢途径能对小鼠的辐射损伤起到防护作用。