家猪先天性耳畸形基因HOXA1因果突变位点的分子机理研究

Ear develops from the first and second branchial archs comprising of cranial neural crest cells. We have previously identified HOXA1 c.451delinsTC to be the causal mutation for a congenital ear defect in a pig population. So we speculate the proliferation and differentiation of cranial neural crest cells in affected pig embryo may be abnormal. What's more, the causal gene HOXA1 is known to be a transcription factor and aberrant traits in HOXA1 mutant mouse and human present to cranial neural crest cell deriving tissues. So we focus on this congenital ear defect pig population and attempt to examine affected and wild type embryos for expression difference of apoptosis and differentiation program markers by immunochemistry and in situ hybridization experiments. At the other hand, we are planning to perform transcriptome sequencing (mRNA, lncRNA and miRNA) using the first and second branchial arch tissues to address the difference of gene transcription between the affected and wild type embryos at a molecular level. By integrating results of the above experiments, we will finally uncover the molecular mechanisms of causal mutation of HOXA1 gene underlying the congenital ear defect in pigs.

耳朵发育自第一、二鳃弓组织，而第一、二鳃弓的主体是颅神经嵴细胞。申请人前期研究已证明导致一个先天性耳朵畸形家猪群体的因果突变是HOXA1 c.451delinsTC位点，推测耳畸形猪胚颅神经嵴细胞的增殖分化存在异常。已知因果基因HOXA1是一种转录因子，该突变导致小鼠和人颅神经嵴细胞的衍生组织中出现异常表型。因此，本项目以此先天性耳朵畸形家猪群体为研究对象，拟利用免疫组化和原位杂交试验，比较患病和正常猪胚颅神经嵴细胞凋亡和分化标记基因表达的差异；同时在分子水平上，利用转录组（mRNA-lncRNA和miRNA）测序检测患病和正常猪胚第一、二鳃弓转录水平的差异。整合上述试验结果，最终探明家猪先天性耳畸形基因HOXA1因果突变位点的分子机理。

小耳畸形症是一种复杂疾病，申请人前期在一个先天性小耳畸形症家猪群体中通过遗传学手段鉴别到了导致该疾病的因果突变位点HOXA1 c.451delinsTC。在此基础上，本项目利用先天性小耳畸形患病个体和正常个体的转录组对比试验，分析致病基因位点的靶基因及作用方式。针对实验群体繁殖力下降的问题，我们首先进行了群体扩繁工作。患病个体和正常全同胞个体耳组织切片的数字电子扫描检测显示，与正常耳组织相比，患病耳组织的表皮厚度显著较低，边缘无明显角质化，软骨占比、成熟毛囊密度、未成熟毛囊密度、肌肉纤维和脂肪组织无差异。患病耳组织表皮中的棘细胞细胞层数相对较少，角质层细胞相对较薄，提示HOXA1可能对棘细胞的增殖有影响。患病和全同胞正常个体的RNA-seq和ChIP-seq的联合分析发现，患病个体中有168个上调peak关联基因，富集在细胞生长分化与迁移、骨骼系统相关的GO条目及能量代谢、细胞增殖生长、黏附和肿瘤相关的信号通路，78个下调peak基因则富集在骨骼发育、能量代谢相关条目及DNA损伤修复和蛋白代谢相关的信号通路。筛选到5个上调差异miRNA，3个下调差异miRNA，靶向基因分别富集于类固醇合成、多能干细胞调控、过氧化物信号通路，及血管平滑肌收缩、自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号通路。检测到692个lncRNA和miRNA的共表达关系，124个miRNA-lncRNA-mRNA和53个circRNA-miRNA-mRNA对应表达关系。经生物信息学和试验分析筛选获得12个关键靶基因，其中SMAD7，TGIF1，THBS1，ACVR1B富集在TGF-β信号通路中，推测HOXA1可能通过作用于TGF-β导致家猪患先天性耳畸形。研究结果加深了人们对小耳畸形症的认识，为人类小耳畸形症致病机理的研究提供了参考。